Cromatografía líquida. Tipos de cromatografía

Cromatografía líquida

Es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. En esta, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.

Tipos de cromatografía

1. Cromatografía de Reparto

El tipo de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) más ampliamente utilizado es la cromatografía de reparto, en la cual la fase estacionaria es un segundo líquido que es inmiscible con la fase líquida móvil.

Al principio, en la cromatografía de reparto se utilizaban columnas del tipo líquido-líquido. En la actualidad éstas han sido reemplazadas porcolumnas de fase líquida unida en los sistemas de cromatografía de líquidos modernos. En la cromatografía líquido-líquido, éstos se mantienen en su lugar mediante adsorción física. Por otro lado, en la cromatografía de fase unida, están ligados por medio de un enlace iónico, lo que da por resultado rellenos muy estables e insoluble  es en la fase móvil.

En cromatografía de reparto, los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones constituidas básicamente por sílice.

Con base en las polaridades relativas de las fases móvil y estacionaria, se distinguen dos tipos de cromatografía de reparto. En un principio, la cromatografía de líquidos utilizaba fases estacionarias de elevada polaridad, como el agua o el trietilenglicol; como fase móvil se empleaba un solvente relativamente no polar, como el hexano o el isopropiléter. Ahora a este tipo de cromatografía se le conoce comocromatografía en fase normal. En la cromatografía en fase inversa,la fase estacionaria es no polar, con frecuencia un hidrocarburo, y la fase móvil es un solvente relativamente polar, como agua, metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano. En la cromatografía en fase normal, el componente menos polar se eluye primero; alaumentarla polaridad de la fase móvil ocasiona una disminución del tiempo de elución. En cambio, con la cromatografía de fase inversa, los componentes más polares aparecen primero y unaumentode la polaridad de la fase móvilincrementa el tiempo de elución.

1. Cromatografía  Iónica

La cromatografía iónica (IC) se refiere a los métodos modernos y eficientes para separar y determinar iones en columnas con relativamente baja capacidad de intercambio iónico o aniónico.

En estas se emplean resinas de intercambio iónico, estas están compuestas de una alta concentración de grupos polares, ácidos o básicos, incorporados a una matriz de un polímero sintético (resinas estirénicas, resinas acrílicas, etc.) y actúan tomando iones de las soluciones (generalmente agua) y cediendo cantidades equivalentes de otros iones.

La cromatografía iónica evolucionó al margen de la cromatografía de intercambio iónico. Esta técnica, a veces llamada también cromatografía de formación de parejas de iones, es un subconjunto de la cromatografía en fase inversa en la cual especies que se ionizan con facilidad se separan en columnas de fase inversa mediante el empleo de un contraion.

1. Cromatografía de Adsorción

La cromatografía líquida de adsorción se caracteriza por utilizar una fase estacionaria sólida (Adsorbente) de carácter polar y una fase móvil líquida (Eluyente) apolar, y se utiliza tanto con fines analíticos (identificación de sustancias) como con fines preparativos (aislamiento), siendo su limitación más importante la dificultad de separar sustancias de polaridad parecida.

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria la constituye un sólido poroso finamente granulado, siendo el proceso de adsorción debido a las atracciones intermoleculares dipolo-dipolo o puentes de hidrógeno entre los componentes de la muestra y el adsorbente. El adsorbente más utilizado es el gel de sílice, aunque también se utiliza alúmina activada: debe tenerse en cuenta que la capacidad de retención de un adsorbente varía en función de su grado de activación que a su vez depende del contenido en agua: La activación requiere eliminar de su superficie el agua adsorbida, operación que se lleva a cabo por secado prolongado a vacío y alta temperatura; aunque un exceso de activación puede producir adsorciones irreversibles e incluso reacciones catalíticas indeseadas. Por otra parte, la fase estacionaria debe ser químicamente inerte con las sustancias que se pretenden separar, por lo que hay que tener en cuenta que el gel de sílice tiene carácter ácido, mientras que la alúmina puede adquirirse con carácter ácido, básico o neutro.

La fase móvil está constituida por una mezcla de disolventes que deben ser, al menos, parcialmente solubles. Para una fase móvil determinada, cuanto más polar sea la sustancia de la muestra, más va a ser retenida por la fase estacionaria (o menos arrastrada por la fase móvil), mientras que por lo que respecta a la velocidad de elución de una sustancia determinada, depende de la naturaleza de la fase móvil: cuanto más polar sea la fase móvil más se desactivará la fase estacionaria y, por lo tanto, menos retenida quedará la sustancia en cuestión.

1. Cromatografía de Exclusión por Tamaño

Lacromatografía de exclusión por tamaño,o de gel, es una técnica muy valiosa que se aplica en particular a especies de elevada masa molecular.

 Los rellenos para la cromatografía de exclusión por tamaño son pequeñas partículas de sílice o de polímeros que contienen una red de poros uniforme en los que se pueden difundir las moléculas del soluto y el solvente. Las moléculas quedan atrapadas en los poros y son eliminadas del flujo de la fase móvil. El tiempo de residencia medio en los poros depende del tamaño efectivo de las moléculas del analito. Las que son más grandes que el tamaño medio de los poros del relleno son excluidas y, por consiguiente, no son retenidas, tales especies son las primeras en ser eluidas. Las moléculas cuyos diámetros son significativamente menores que los poros pueden penetrar a través de ellos y así pasan mucho tiempo atrapadas; éstas son las últimas en ser eluidas. Entre estos dos extremos están las moléculas de tamaño intermedio cuya penetración media en los poros depende de su diámetro. Dentro de este grupo tiene lugar la división, que está directamente relacionada con las dimensiones de la molécula y, en cierto modo, con la forma molecular. Las separaciones por exclusión por tamaño difieren de los otros procedimientos que se han considerado en que no hay una interacción química o física entre los analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo de interacciones dado que originan una baja efectividad de la columna. A diferencia de otros tipos de cromatografía, hay un límite superior para el tiempo de retención, ya que ningún analito es retenido más que aquel que atraviesa por completo la fase estacionaria.

Aplicaciones         

Campo de aplicación de la cromatografía de líquidos de alta resolución:

Esta se considera como la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada, las razones de su popularidad son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para automatizarla, su capacidad para separar especies no volátiles o termolábiles, pero más importante, su amplia aplicabilidad a sustancias que son importantes en la industria, muchos campos de la ciencia y para la sociedad.

Algunos ejemplos de estos materiales son: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una variedad de sustancias inorgánicas.

Cromatografía de reparto

Cuando se utilizan rellenos unidos químicamente en fase inversa junto con los solventes muy polares se aproximan al sistema ideal y universal para la cromatografía de líquidos. Esta tiene una gran conveniencia ya que tiene la facilidad de modificar k y Alpha al variar las fases móviles acuosas, estos rellenos se aplican con frecuencia antes que todos los otros en el caso de separaciones de exploración con nuevos tipos de muestra.

Formación de derivados: En ocasiones, la mejor opción es convertir los componentes de una muestra a un derivado antes o (en algunos casos) después de la separación cromatográfica. Tal tratamiento puede ser deseable por varias razones, como para reducir la polaridad de la especie y poder utilizar la división de columnas más que la adsorción o intercambio de iones, para aumentar la respuesta del detector y así la sensibilidad para todos los componentes de la muestra, y para realzar selectivamente el detector a ciertos componentes de la muestra.

Aquí se pueden ver los campos de aplicaciones y las mezclas características de cada uno.

• Fármacos: Antibióticos, sedantes, esteroides, analgésicos.
• Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos.
• Productos alimenticios: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos.
• Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes.
• Contaminantes: Plaguicidas, herbicidas, fenoles, bifenilos policlorados.
• Ciencias forenses: Fármacos, venenosos, alcohol en sangre, narcóticos.
• Química clínica: Ácidos biliares, metabolitos de fármacos, extractos de orina, estrógenos.

Cromatografía de exclusión por tamaño

Antes que todo, debemos destacar que los métodos de filtración sobre gel y el de penetración sobre gel son complementarios porque el primero se aplica a muestras solubles en agua y la segunda para sustancias en solventes orgánicos menos polares.

Una de las aplicaciones más útiles de este procedimiento es la separación de las moléculas de elevada masa molecular, de productos naturales de las especies de baja masa molecular y de las sales.  Un buen ejemplo es que un gel con un límite de exclusión de varios miles puede separar con claridad las proteínas de los aminoácidos y de los péptidos de baja masa molecular. Otra aplicación útil de esta es la separación de homólogos y oligómeros.

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