Cuantificacion De Proantocianidinas

Preparación de reactivos para el método Bl-dmac. (Dimetilacetamida).

1.- PAC extracción con disolvente. Acetona (75 ml) se transfiere a una botella de vidrio que contiene 24,5 ml de agua desionizada y se añade 0,5 ml de ácido acético.

2.- Etanol acidificado. Ácido clorhídrico concentrado (36 %) (12,5 ml) se añade a 12,5 ml de agua destilada y 75 ml de etanol (91 %) en una botella de vidrio y se mezcla.

3.- Solución de dilución. Etanol (91 %) (80 ml) se añade a 20 ml de agua desionizada y se mezcla.

4. - Solución de elución. Etanol (91 %) (80 ml) se añadió a 19,5 ml de agua desionizada, 0,5 ml de ácido acético y se mezclan.

5.- DMAC reactivo (0,1 %). DMAC (0,05 g) se pesó y añadido a 50 ml de etanol acidificado (reactivo 2, arriba). Este reactivo se elabora todos los días.

Estándares

Cada laboratorio fue el responsable de la compra de los estándares (100 mg ml -1). Procianidina A2 (5 mg) se pesó y cuantitativamente transfirió a un matraz aforado de 50 mL. Etanol (91 %) se añadió para dar una concentración final de 100 mg ml - 1.

Las alícuotas se colocaron en 1,5 ml de los viales de muestra de HPLC y se almacenan a -80 ◦ C. Estos estándares fueron estables durante al menos 6 meses.

Un control de procianidina A2 se preparó mediante la transferencia de 1 ml de los 100 mg ml – 1 y añadir a un tubo cónico de 1.5 mL, y 250 μL de etanol ( 91 %) y se agitaron para dar una 80 mg mL-1 procyanidin A2 como una muestra de control.

Extracción de PACs a partir de polvos de arándano

Polvos secos de todo, ya sea de arándano o no selectivo de alimentos concentrados grado de arándano se pesaron (20-1000 mg) en un tubo cónico de 50 mL. La solución de extracción PAC (20 ml) se añadió a las muestras. Las muestras se agitaron en vórtex durante 30 s seguido por sonicación a temperatura ambiente durante 30 min. Muestras a continuación, se colocaron en un agitador orbital durante 1 h y posteriormente se centrifuga a 2000 × ga 20 ◦ C durante 10 min. El sobrenadante es recogido para el análisis.

El protocolo de lector de placas se estableció para leer la Absorbancia (640 nm) de cada pocillo en la placa de cada minuto durante 30 min. La frecuencia de la lectura puede variar con el lector de micro placas particular utilizado. La placa incluye espacios en blanco, normas, controles, y las incógnitas en la serie diluciones de 1, 2, 4, 8, 16 y 32 veces , según corresponda.

Analisis

La cámara de incubación se precalienta a 25 ◦C, y el sistema de se dejó equilibrar. Una pipeta digital fue utilizado para dispensar en pocillos de una placa de 96 pocillos uno de los siguientes: (1) 70μl de Etanol al 80 % para los blancos; o (2) 70 μ l de control, estándar, y muestras.

La solución de DMAC (210 μl) se añadió mediante un multicanal pipeta en los 96 pozos (que contiene espacios en blanco, estándares, controles y muestras). Dependiendo de la marca de lector de placas, algunas utilizó una pipeta automática en el lector de placas añadir la solución de DMAC. El volumen final fue de 280 l bien - 1. La microplaca fue leída durante 25 min.

Cálculos y análisis estadísticos

Las lecturas de Absorbancia máxima se utilizaron para el cálculo, que generalmente producido antes de 20 min, dependiendo de la dilución de la muestra. Se calcularon las absorbancias corregidas restando la Absorbancia del blanco media y una calibración curva se genera a partir de los estándares. Concentraciones de PAC se calcularon mediante el uso de una ecuación de regresión (Y = a + bx) entre la concentración de Procianidina A2 ( Y) ( g ) y el máximo Absorbancia menos el blanco ( X).

Las concentraciones

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