La criopreservación

INTRODUCCIÓN

     La criopreservación es el proceso por el cual un material biológico, ya sea  células o tejidos, es congelado a bajas temperaturas. El objetivo de este método es detener las funciones vitales de una célula u organismo, para así poder mantenerlo viable y funcional por periodos largos de tiempo.  Sin embargo, este no es un proceso libre de problemas, ya que puede inducir variaciones de las propiedades térmicas, químicas y eléctricas de las células, alterando las membranas celulares, organelos y la interacción célula-células de los tejidos a criopreservar principalmente por los el procesos de congelación previo y la descongelación que se realizan posterior. 

     Conocer, entender y aplicar la de forma más adecuada para la criopreservar ción de muestras biológicas, es fundamental en laboratorios y bancos de células. Así, la criopreservación de glóbulos rojos resulta ser útil en medicina transfusional cuando se requiere almacenar por mas de 42 días  eritrocitos de: grupos sanguíneos raros carentes de  antígenos de alta frecuencia, eritrocitos o que presentan antígenos de baja o alta frecuencia en la población, con el fin de proporcionar unidades de glóbulos rojos a los pacientes que lo requieran de estas caracteristicassi presentan un perfil serológico que así lo determine; b) en autotransfusión de cirugías cesareas obstétricas programadas, cuando se sospeche un riesgo de sangrado mayor a lo habitual, evitándose los inconvenientes de la autodonación en el tercer trimestre del embarazo programadas; c) para la obtención de reservas de glóbulos rojos sangre O Rh D positivo a y/o O Rh D negativo a si se producen catástrofes civiles, catástrofes naturales o en enfrentamientos armados. d) en el tratamiento de ciertas patologías adquiridas en que ocurre destrucción de glóbulos rojos, como por ejemplo, la hemoglobinuria paroxística nocturna.

     En medicina transfusional las soluciones criopreservantes deben asegurar el mantenimiento intacto del fenotipo eritrocitario, su funcionalidad y un mínimo desarrollo microbiano durante el tiempo de conservación. Por lo tanto, es importante establecer un  protocolo adecuado que garantice la eficacia de la técnica, además de un sistema de seguridad y control de calidad continuo para la técnica utilizada.

OBJETIVOS

Objetivo general

Estandarizar un método para la criopreservación de glóbulos rojos para ser utilizado en medicina transfusional.

Objetivos específicos

• Conocer las características de la membrana del glóbulo rojo y su afección por la congelación

• Conocer los factores que inciden en la viabilidad del glóbulo rojo durante el descongelamiento de éste.

• Determinar una técnica de criopreservación adecuadas para glóbulos rojos, estableciendo su uso, ventajas y desventajas.

• Establecer y controlar  un procedimiento que permita criopreservar glóbulos rojos.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

     La criobiología es la rama de la ciencia que estudia el comportamiento de  células, tejidos, órganos y organismos sometidos a temperaturas por debajo de 0º Celsius. El vocablo “criobiología” proviene del lenguaje griego κρύος (kryos) que significa frío,  βιος (bios) que significa vida y λογος (logos) que significa ciencia. La crioprecipitación es el proceso por el cual material biológico es congelado y tiene como objetivo la conservación del carácter vital de cualquier tejido o conjunto celular por medio del frío, usando las bajas temperaturas como herramienta para mantener la vida en suspensión por tiempos prolongados, permitiendo reconstituir la viabilidad y funcionabilidad biológica del material, en el momento oportuno según su utilización.  

     La temperatura de congelación ideal dependerá del tipo de muestra a almacenar y ésta debe permitir la remoción completa del agua, deteniendo las reacciones de degradación y la actividad biológica, además a dicha temperatura la energía cinética de la célula debe baja y la difusión prácticamente nula, lo que permite mantener tanto el aspecto macroscópico como molecular del material biológico.

     La historia de la criobiología se remonta al año 2500 a. C. cuando los egipcios utilizaban bajas temperaturas con fines medicinales. Años después Hipócrates recomendó el uso del frío para detener el sangrado y la hinchazón, práctica que aún se realiza. Posteriormente, Robert Boyle estudió los efectos de las bajas temperaturas en animales y desde el año 1950 en adelante, distintos científicos han tratado de criopreservar espermatozoides humanos. En argentina, en el año 1997, se obtuvo el nacimiento de un bebé a partir de un óvulo conjugado. En el año 2000 nació el primer bebé de un óvulo fertilizado por semen criopreservado y actualmente, existen alrededor de todo el mundo bancos de tejidos para el diseño de distintos tipos de material biológico, con el fin de almacenar a largo plazo estos materiales y utilizarlos  en aplicación terapéutica de  medicina transfuncional.

  El principal problema de la crioprecipitación lo constituye la formación intracelular y extracelular de cristales de hielo durante la congelación del agua. En este punto, un principio básico de la criopreservación es que la cantidad del daño provocado por la congelación depende de la cantidad de agua libre en el sistema, pues como se sabe, el agua es el principal componente de todos los sistemas vivos y debe estar presente dentro de la célula  para que se produzcan las reacciones metabólicas.              Cuando el hematíe ha perdido aproximadamente el 64% de su contenido acuoso no resiste más la reducción,  se produce un gradiente osmótico en la membrana y una entrada de sal, dañándose la membrana (Meryman, 1970)

     La formación de hielo parte en el espacio extracelular, provocando un aumento de la concentración de sales debido a la disminución del agua cuando ésta se transforma en hielo, por lo cual el líquido restante se convertirá en hipertónico. Por otra parte, los cristales de hielo intracelulares pueden comprimir organelos celulares o bien comportarse como cuchillas que cortan las estructuras internas. Además, entre los 0 y -30ºC el hielo es dinámico, cambiará de estructura continuamente, acentuando lo anteriormente descrito. Todos estos efectos pueden minimizarse con las siguientes acciones: a) Controlando la velocidad de congelación y la tasa de enfriamiento mediante el uso de un congelador con control de velocidad y tasa de congelación;  b) Deshidratando la célula  antes de congelarla mediante la sustitución del agua por criopreservantes que mantengan el equilibrio osmótico; c) Controlando el tiempo y temperatura de descongelación para reducir la toxicidad química de los agentes criopreservantes.

     Los criopreservantes son compuestos químicos que permiten la mantención de un material biológico sometido a bajas temperaturas, protegiendo a las células a través de la eliminación de las elevadas concentraciones de sales, reduciendo el encogimiento celular a una determinada temperatura, reduciendo la fracción de la solución congelada a una determinada temperatura o minimizando la formación de hielo intracelular.

     La clasificación de los criopreservantes está dada por  la capacidad y velocidad de penetrar los tejidos, el peso molecular, la toxicidad química o/y el grado de protección que confieren.  De esta manera, una clasificación puede ser la siguiente:

Agentes penetrantes.  Son compuestos de bajos pesos moleculares y permeables a través de la membrana. Actúan desplazando el agua del interior de la célula evitando así la formación de cristales de hielo intracelulares y por ende reduciendo el número de células lisadas. Se deben utilizar a velocidades de congelación lenta y los más comunes son:

• Dimetil sulfóxido (DMSO): muy tóxico a temperatura ambiente, se debe aplicar a bajas temperaturas para obtener buenos resultados.
• Glicerol: origina una fase líquida con una distribución salina tal que a medida que avanza el proceso de congelación se evita la hipertonicidad (Lovelock, 1953).
• Etilenglicol
• 1,2-Propanodiol (PROH)

Agentes no penetrantes: son compuestos de alto peso molecular, impermeables a la membrana, que actúan promoviendo una rápida deshidratación de la célula. Se utilizan en congelaciones a velocidades muy altas y los más conocidos son:

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