Laboratorio de Genética Microbiana Práctica No. 1 “Aislamiento y caracterización de DNA”.

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL[pic 1][pic 2]

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Laboratorio de Genética Microbiana

Práctica No. 1 “Aislamiento y caracterización de DNA”.

Alumna: Alarcón Adame Mitzi Nayeli

Grupo: 5QV1                          

Equipo: 1                  Sección: 1

Introducción

Partiendo de los resultados del análisis por rayos X de fibras de DNA y de las equivalencias de bases en el DNA, Watson y Crick postularon que el DNA nativo consta de dos cadenas anti paralelas dispuestas en doble hélice con las bases complementarias AT-GC apareadas por enlaces de hidrógeno y situadas en el interior de la hélice, mientras que el esqueleto covalente reside en el exterior, cada una de las hélices es un polímero integrado por millones de nucleótidos que son los monómeros del polímero (cada nucleótido está formado por una desoxirribosa, una base púrica o pirimídica y un grupo fosfato). Los pares de bases están estrechamente apilados  dispuestos perpendicularmente a lo largo del eje, separados a una distancia de 0,3 nm, el diámetro de la doble hélice es de unos 2.0 nm, esta estructura proporciona una explicación de la replicación exacta de las dos hebras.  

En general, la estructura secundaria del DNA nativo depende del contenido de sus bases nitrogenadas. Entre mayor sea el contenido de G + C mayores serán las fuerzas que mantienen juntas a las dos cadenas, esto es posible debido a que la Guanina y la Citosina pueden formar tres puentes de hidrógeno. Los dúplex de DNA experimentan por calefacción un desenrrollamiento (desnaturalización) durante el cual aumenta su absorción de la luz a 260 nm (efecto hipercrómico), los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de DNA que tiene su absorbancia máxima en 260 nm (al igual que el RNA y las proteínas tienen un rango de absorción aproximado de 210 nm  a 300 nm). La absorción de UV de DNA es una característica  de la molécula, que es usada eficientemente para determinar su concentración y su pureza.

El aislamiento, purificación y demás manejos de moléculas de DNA y/o RNA se dispone de diferentes metodologías conformadas por distintos elementos, según el origen del DNA y finalidad del estudio. En el aislamiento del DNA, una gran dificultad es el de mantener una molécula tan larga y rígida físicamente intacta. Se ha demostrado que las fuerzas de fricción que se establecen cuando una solución de DNA es agitada vigorosamente, son suficientes para romper la larga y rígida molécula de DNA. Las moléculas se rompen primero cerca de la parte media, después en cuartos y así sucesivamente hasta que se alcanza un tamaño lo suficientemente corto para que la molécula sea relativamente insensible a la ruptura por fricción. Un método para aislar DNA casi libre de proteínas y RNA fue publicado, por Marmur, este procedimiento proporciona DNA biológicamente activo, sin embargo, el DNA obtenido es de alguna manera degradado por las fuerzas de fricción desarrolladas durante la agitación. Un procedimiento alternativo para el aislamiento de DNA altamente polimerizado a partir de tejidos animales es el método de extracción con Fenol de Kirby, en el cual las proteínas son desnaturalizadas en la interface fenol-agua y los ácidos nucleicos son extraídos en la capa acuosa.

OBJETIVOS

• Aislar el DNA cromosómico de alto peso molecular, a partir de un cultivo bacteriano.
• Establecer el espectro de absorción del DNA aislado.
• Determinar la concentración y grado de pureza del DNA obtenido.
• Determinar la influencia de algunas características de la secuencia del DNA sobre su desnaturalización empleando el programa bioinformático DNAMAN.

MODIFICACIONES EN EL DESARROLLO EXPERIMENTAL

Se realizó una modificación en el punto número 13 del desarrollo de experimental, en el que se sustituyó la adición de 500 µL de isopropanol por 1 mL de etanol absoluto. Los demás pasos realizados en la práctica se siguieron de acuerdo al procedimiento indicado en el manual de prácticas (pg. 5)

RESULTADOS

Tabla 1. 1 Lectura de la absorbancia obtenida a un intervalo de longitudes de onda de 220-230 nm del DNA aislado de Escherichia coli W3350

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE DNA

1. Cálculo de la concentración de DNA mediante la fórmula:

[pic 3]

Dónde:

C = concentración (g/mL)

Ae = índice de absorción específica (22,500 para el DNA)

b = paso de la luz de la celda, en centímetros

Sustituyendo la absorbancia en la fórmula tenemos:

[pic 4]

b) Cálculo de la concentración, siguiendo la relación:         

1 Unidad de As de 260 nm de doble cadena ------------------ 50 μg / mL de DNA de doble cadena

                                             16.423 nm ------------------ x

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