Los mejores Materiales y métodos

Materiales y métodos

Primero se preparó una muestra de hígado de pollo que anteriormente fue lavado con suero fisiológico. Luego se homogenizó el tejido utilizando el ULTRA-TURRAX. Así en esta etapa se obtiene el homogenizado total (HT). Después se filtró este con la ayuda de una gasa ubicada sobre un embudo de vidrio. A la Post- filtración de este se le denomina homogenizado crudo (HC) el cual se recibió en un tubo Falcon, se rotulo y se mantuvo en hielo para así poder evitar la degradación de estructuras celulares de la muestra.

Se mantuvo el HC en hielo y se repartió un volumen de 10 mL. Luego se guardó  1 mL de HC en un tubo eppendorf de 1.5 mL y este se conservó en hielo.

Los 9 mL restantes de HC se centrifugan a 2000 RPM por 10 minutos aproximadamente y con una temperatura de 4°C. En esta primera centrifugación se obtuvo un pellet 1 y un sobrenadante 1.

Luego de esto se transfirió  el sobrenadante a un tubo Falcon de 15 mL rotulándolo como SN1,  y el pellet 1 obtenido se resuspendió  con 1 mL de buffer IBc y se conservó en frio.

Se hace una segunda centrifugación con el sobrenadante 1 a 7000 RPM por 20 minutos aproximadamente y con una temperatura de 4°C.

Después de esto se observó en un microscopio óptico las fracciones.

Lo primero que se hizo fue colocar una gota de la suspensión de núcleos (P1) con la ayuda de un gotario en un porta objetos. Sobre esta muestra se colocó un cubre objetos y se observó con un lente objetivo de 40x.

Luego de esto se preparó una nueva muestra de núcleos, igual que en el proceso antes dicho, pero esta vez se adiciono una gota de azul de tripán con ayuda de gotario sobre los núcleos y  sobre este se colocó el cubreobjetos. Luego se observó esta muestra con el lente objetivo 40x y se hizo las respectivas observaciones al respecto.

Como última actividad se hizo la evaluación del fraccionamiento subcelular mediante marcadores. Principalmente esta actividad consistió en la detección de mitocondrias a través de actividad de la enzima Succinato deshidrogenada  SDH.

Lo primero que se hizo fue rotular cada tubo de eppendorf con el nombre de las respectivas muestras que se analizó y estas se colocaron en hielo para que se mantuvieran fríos. Se agregó a cada uno de los tubos: 400 ul de agua destilada, 400 ul de homogenizado crudo (HC), 400 ul de Pellet 1 (P1), 400 ul de  Pellet 2 (P2) y finalmente 400 ul de sobrenadante 2 (SN2). Con la ayuda de  una pipeta  de 200 ul se le agrego a cada muestra  las siguientes soluciones en la misma cantidad a cada uno: 400 ul de succinato 0,1 M,  100 ul de azul de metileno y  400 ul de agua destilada .Por cada muestra se usó distintas puntas de pipetas para así no contaminar estas. Posteriormente se agitó cada tubo y se le agrego 200 ul  de vaselina liquida el cual no se agitó.

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