Macrofagos Afectados Pro E Alcohol

EFECTOS AGUDOS DEL ALCOHOL EN LA RESPUESTA INMUNE

E. Garcíaa, L. I. Terrazasb , I. Riverab , M. Rodríguez-Sosab

a Módulo de Instrumentación y Laboratorio de la Carrera de Médico Cirujano. Facultad de Estudios Superiores Iztacala. UNAM. Tlalnepantla Edo. de México. egarcia@campus.iztacala.unam.mx

b Unidad de Biomedicina, Lab de Inmunoparasitología. Facultad de Estudios Superiores Iztacala. UNAM. Tlalnepantla Edo. de México. rodriguezm@campus.iztacala.unam. mx

RESUMEN:

El consumo de alcohol es reconocido como un riesgo para el desarrollo de diversas enfermedades así como para las infecciones oportunistas. En este estudio nosotros examinamos los efectos del etanol sobre el sistema inmune en un modelo de ratón. Ratones hembras BALB/c fueron tratadas intraperitonealmente con 400μl de etanol al 20% v/v- sol. salina y como controles se utilizaron ratones tratados únicamente con sol. salina. Se evaluó el número de células totales del bazo, la proliferación celular y la producción de citocinas de estas células estimuladas con Con A (IL-4, IL-10, IFN- y TNF-). Se obtuvieron macrófagos de la cavidad peritoneal y se estimularon con LPS, y se determinó la producción de TNF-Se analizó el reclutamiento de células F4/80+/Gr1+ en la cavidad peritoneal. Los resultados obtenidos mostraron que la administración de etanol no modificó el número de células totales de bazo, pero sí redujo la capacidad de respuesta proliferativa de las células. Los linfocitos de ratones tratados con etanol tuvieron un incremento en la producción de citocinas proinflamatorias, sin embargo la producción de TNF-enlos macrófagos se vió afectada negativamente. Por otro lado, el etanol indujo el reclutamiento de células supresoras F4/80+/Gr1+. Lo anterior sugiere que la exposición aguda al etanol puede facilitar un estado de inmunosupresión.

INTRODUCCIÓN:

México es una de los países mas afectados por el consumo de alcohol a nivel mundial, según la Encuesta Nacional de Adicciones en 2002 el abuso del alcohol y la dependencia al mismo se ha incrementado en los últimos años. El consumo en la población urbana alcanza 35% de la población masculina y 25% de la femenina. Según el Sistema de Diagnóstico para Enfermedades Mentales de la Asociación Psiquiátrica Americana en su cuarta revisión (DSM-IV), 281,907 adolescentes (2.1% de la población rural y urbana) cumplieron con el criterio de dependencia La población urbana adulta alcanzó el 72.2% para hombres y 42.7% en mujeres.1 En el informe de la OMS sobre la salud en el mundo del 2003 el consumo de alcohol es reconocido como un riesgo relacionado con enfermedades de depresión unipolar, enfermedades cerebro vasculares, accidentes automovilísticos e isquemias del corazón, siendo responsable del 9.3% de años de vida perdidos por enfermedad (AVISAS) (14% hombres y 2.4% mujeres). 2 Por otro lado es bien conocido que la dependencia al alcohol ocasiona la muerte a pacientes por cirrosis hepática, hipertensión portal, ruptura de varices esofágicas ocasionando la muerte prematura en estos pacientes.3-4 Además, existen otras enfermedades con incidencia muy alta en pacientes alcohólicos como son el cáncer, la desnutrición, la anemia megaloblástica y las infecciones respiratorias. Kanagasundram y Leevy (1981) mencionan que el uso agudo, moderado o crónico de la ingesta de alcohol aumenta la susceptibilidad a infecciones causadas por diferentes patógenos tanto bacterianos como virales.5 Ruiz y cols. refieren que la ingesta de alcohol mayor a 80 gramos por día es un factor de riesgo para adquirir neumonía severa y el agente mas frecuente es Streptococcus neumoniae seguido de bacilos Gram-negativos entericos y Pseudomonas aeruginosa.6

La primera línea de defensa, conocida como respuesta inmune innata, intervienen células fagocitarías así como el sistema de complemento y moléculas proinflamatorias tales como IFNγ citocinas IL-1, IL-6, IL-12 y el factor de necrosis tumoral α que generan una respuesta de tipo Th1. Por otro lado, la respuesta inmune adaptativa es una protección específica contra agentes infecciosos los cuales pueden ser neutralizados por la producción de anticuerpos y citocinas como son la IL-4, IL-10 dando lugar a una respuesta de tipo Th2.7 Nelson y Kolls (2002) mencionan que el efecto del alcohol repercute en el sistema inmunológico a diferentes niveles. El consumo agudo de alcohol afecta a los macrófagos alveolares reduciendo su capacidad de fagocitar así como también interfiriendo en la producción de TNF-α e interleucina 1β. A nivel de linfocitos polimorfonucleares reduce la quimiotaxis, la adherencia de CD18, en las células T aumenta la apoptosis y disminuye la producción de IL-17.8 Frank y col. (2004) aseveran que el alcoholismo crónico altera la respuesta inmune innata y después de retirar el consumo de alcohol por dos semanas la respuesta inmune adaptativa no responde apropiadamente, dando lugar a la predisposición de infecciones y sepsis.9 Goral y Kovacs (2005) reportan que los efectos del alcohol inhiben la producción de IL-6 y del TNFα lo que da lugar a la inhibición de la respuesta inflamatoria del macrófago.10 Por otro lado, Terrazas, y col (2001) encontraron que los macrófagos, fenotípicamente definidos como Gr1+/CD11b+/F4/80+, inhiben la proliferación in vitro de los linfocitos TCD4+11. En este trabajo, nosotros evaluamos el efecto de la exposición aguda al etanol en la respuesta de los macrófagos a substancias inflamatorias, así como la respuesta proliferativa de linfocitos T, además del reclutamiento temprano de células peritoneales expuestas al etanol. Los datos obtenidos reflejan un efecto diferencial dependiendo de la población celular estudiada. In vivo, el etanol recluta una población de células que expresan F4/80+/Gr-1+, este marcador se ha asociado a una población de macrófagos que inhibe la proliferación celular, por tal motivo la exposición aguda al alcohol podría potencialmente inducir un estado de inmunosupresión.

METODOLOGÍA:

Animales, se utilizaron ratones de fondo genético BALB/c, hembras entre 8-10 semanas de edad de los laboratorios Jackson, los cuales han sido mantenidos por más de 4 generaciones en el bioterio de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala en condiciones libres de patógenos de acuerdo con la norma mexicana NOM-062-ZOO-2001.

Administración de etanol, los ratones se dividieron en dos grupos de forma aleatoria. Al primer grupo se le inyecto vía peritoneal 400 μl al 20% v/v de etanol en sol. salina (Pisa) (aproximadamente 2.9g/kg. de peso de etanol), 24 hr y tres hr antes de sacrificarlos. El segundo grupo (control) fue tratado de igual manera pero en lugar de etanol se le administró 400 μl de sol. salina.

Cultivo de macrófagos, tres hr después de la última dosis de etanol los ratones fueron sacrificados en cámara de CO2 y se procedió a la obtención de células en condiciones de esterilidad. Brevemente, se les administró 5 ml de solución salina estéril fría para realizar lavado peritoneal, previo masaje, se extrajo aproximadamente 5 ml de liquido intraperitoneal. Se centrifugo a 2500 rpm por 10 min. Se resuspendió el botón agregando 1 ml de sol. hemolisante (cloruro de amonio, Pharmingen) por 10 min. Se lavaron con medio Advanced D-MEM suplementado con 5% de Suero Fetal Bovino, 100 unidades de penicilina/estreptomicina, con D-glucosa a 4500mg/L, con NEAA, con piruvato de sodio a 110 mg/L y L-glutamina (GIBCO). Las células viables por exclusión de azul tripano se contaron en cámara de Neubauer y se ajustaron 1x 106 cels/ml. Se sembró 1 ml en cajas de cultivo de 24 pozos, dos hs después fueron removidas por lavado con medio D-MEM las células no adherentes, las células adheridas se removieron con PBS-EDTA estéril (5mM) y reajustaron a 5x 105 cel/ml), se resembró 1 ml en cajas de 24 pozos y se estimularon con lipopolisacarido (LPS) (5 μg/ml, Escherichia coli SIGMA) por 48 hs a 37ºC y 5% de CO2. El sobrenadante se congelo a -70 oC hasta su uso para la determinación de citocinas.

Cultivo de células totales de bazo, brevemente, una vez obtenidas las células de la cavidad peritoneal, en condiciones de esterilidad se removió el bazo. Se obtuvieron los linfocitos de bazo por perfusión del mismo con sol. salina estéril. El perfundido se centrifugo a 2500 rpm durante 10 min., se resuspendió del botón de células y se agrego 1 ml de sol. hemolisante durante 10 min para lizar las células rojas, para detener la reacción se llevo a un volumen de 10 ml con solución salina de Hanks (sin rojo fenol ni NaHCO3 marca MICROLAB), se centrifugo por segunda ocasión con medio y se ajustaron las células a una concentración de 5X106 por ml se colocaron en placas de 24 pozos y se estimularon con 5 mg. de Con A (0.5μg/500 mil células) tanto para el grupo control sin etanol como para el grupo con etanol. Se incubaron 48 hrs. a 37º y 5% de CO2 .

Detección de citocinas, los niveles expresión de IFN-, TNF-, IL-4 e IL-10 en los sobrenadantes de los cultivos de macrófagos como de linfocitos fueron cuantificados por la técnica de ELISA-Sandwich usando pares de anticuerpos y como estándares de referencia se utilizaron citocinas recombinantes, todo marca Pharmingen. Brevemente, las placas para ELISA se recubrieron con el anticuerpo de captura correspondiente, tras una incubación de 12 hs, se pusieron las muestras de los sobrenadantes de los cultivos celulares y la curva de referencia para la citocina correspondiente, después de incubar por 12 hs, se removió la muestra y se añadió el anticuerpo de detección secundario marcado con biotina, se incubaron por 1 hr y se removió para agregar avidita peroxidasa, se incubaron por 30 min y se revelaron por adición del sustrato ABTS. Los ELISAS desarrollaron color en un periodo de tiempo de 10 a 30 min, se leyeron un lector para placas de ELISA (Thermo Labsystems) a 405nm.

Citometría de flujo para marcadores de membrana, macrófagos peritoneales de los ratones tratados con etanol y no tratados (controles) fueron procesados para la detección de los marcadores de membrana F4/80 y Gr1, los cuales estaban marcados con ficoeritrina y fluoresceína, respectivamente. Brevemente, las células se lavaron con PBS-2% de suero fetal bovino inactivado (Gibco) y 0.02% de azída de sodio (Sigma); 1X106 células fueron incubadas con los anticuerpos primarios correspondientes a una concentración de 1 g/ml (Pharmingen) en tubos para citometría de flujo de 5 ml (Falcon) por 30 min a 4oC en obscuridad. Las células se lavaron tres veces por centrifugación a 2000 rpm con la sol. de lavado (PBS-BSA2%) y fijadas con paraformadehido al 1 % (ICN) en PBS frió con 0.02% azída de sodio. Se evaluaron 10 000 eventos por cada muestra en el FACscan, usando el sofware Cell Quest (Becton Dickinson). Las células viables fueron electrónicamente “gated” usando los parámetros forward y side.

Análisis estadístico de los datos, se utilizó la prueba “t” de students no pareada para determinar la significancia de los valores obtenidos

RESULTADOS Y DISCUSION:

La administración de etanol no modifica el número de células totales de bazo: La remoción del bazo, extracción y cuantificación de las células totales del mismo demostró que dos dosis de etanol (400 μl al 20% v/v de etanol/sol. salina) con diferencia de 24hs, vía intraperitoneal no fue suficiente para modificar el número de células totales del bazo ya que no hubo diferencias estadísticamente significativas comparadas con el grupo control que no recibió etanol (Gráfica No. 1).

Gráfica 1

La administración aguda de etanol reduce la capacidad de respuesta proliferativa de células de bazo e incrementa la producción de citocinas proinflamatorias : La activación de las células totales de bazo con el mitógeno concanavalina A (ConA) de los ratones que recibieron etanol se vio afectada de manera negativa, es decir la capacidad de proliferación celular disminuyó de manera significativa (Gráfica 2), además cuando se evaluó la producción de IFN- y TNF- en los sobrenadantes de estos cultivos celulares se observó claramente como la administración de etanol indujo la sobreproducción de estas dos citocinas proinflamatorias (Gráfica 3 y 4). Sin embargo cuando se cuantificó la producción de IL-4 e IL-10 estas no se modificaron, demostrando que el etanol afecta de manera selectiva las capacidades de las células de bazo.

Gráfica 2 Gráfica 3 Gráfica 4

Gráfica 5 Gráfica 6

La administración de etanol disminuye la producción de TNF-en los macrófagos. Cuando los macrófagos de ratones expuestos a etanol fueron estimulados con LPS, la respuesta a este estímulo pro-inflamatorio fue deficiente, debido a que la producción de TNF- fue significativamente menor cuando se comparó con los ratones control (Gráfica 7)

Gráfica 7

El Etanol induce el reclutamiento de células supresoras F4/80+/Gr1+. Las células del peritoneo de los dos grupos de ratones experimentales fueron marcadas por F4/80, marcador específico de macrófagos y Gr1, una molécula de membrana que se ha asociado a macrófagos supresores de la respuesta proliferativa de los linfocitos. Como se puede observar en la gráfica 8 los ratones que recibieron etanol tuvieron un aumento significativo del porcentaje de células F4/80+/Gr1+ (6.2% y 6.6%) en comparación con los ratones que sólo recibieron sol. salina (0.7% y 1.2%). Además, se pudo observar un aumento muy importante en las células Gr1+ (probablemente neutrófilos) en estos mismo animales. Lo que sugiere que la presencia de etanol puede alterar las poblaciones de células de la inmunidad innata.

Gráfica 8

BIBLIOGRAFÍA

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