Microscopios

PRINCIPIOS FISICOS DEL MICROSCOPIO DE LUZ

Refracción:desviación que sufre la luz al pasar el límite entre dos medios transparentes y de diferente densidad, tales como el aire y el cristal de una lente. El ángulo de refracción depende del ángulo de incidencia de la luz, de su frecuencia de onda y de la diferencia de densidad. Por estas razones, las lentes convexas convergen la luz en unpunto (punto focal), mientras que las cóncavas ladispersan, mientras que la luz blanca sedescompone en los colores del arco iris, ya que cadacolor tiene diferente frecuencia de onda.

Aumento:relación entre el tamaño aparente y el tamaño real de un objeto,logrado con un sistema óptico.

El término también se usa para señalar lacapacidad de una lente ya probada.

Ejemplo

: el diámetro real de un eosinófilo es de aproximadamente 20 µm o 0,02 mm.La imagen en una micrografía es de 2 cm o 20 mm. Calcule el aumento logradoAumento= Tamaño aparente/ Tamaño real; las unidades de medida se cancelan;20 mm / 0,02mm= 2.000 aumentos: El objeto se ve 2.000 veces más grande

Si usted imprime este documento, mida con una regla la longitud de esteeosinófilo y calcule el aumento tomando en cuenta que el tamaño real es elindicado en el ejemplo.EL AUMENTO EN UN MICROSCOPIO COMPUESTOEjemplo:

La lente objetivo tiene una potencia de 60 aumentos (60X), la lente oculartienen una potencia de 12 aumentos (12X). Calcule el aumento total que se obtienecon esta combinación de lentesAumento

total

= Aumento

lente objetivo

x Aumento

lente ocular

.60 aumentos x 12 aumentos= 720 aumentos: El objeto se verá 720 veces más grande.Las lentes objetivo suelen ser de 2, 4, 5, 10, 20, 40, 60 y 100 aumentos, las lentesoculares vienen de 4, 5, 8, 10, 12 y 20 aumentos. Calcule todos los aumentos totalesposibles.3.

Poder de Resolución:capacidad de un sistema óptico de discernir comoobjetos independientes aquellos objetos que están separados pero muypróximos entre sí.

El poder de resolución de un sistema óptico depende de lalongitud de onda utilizada para la observación. En líneas generalescorresponde a la mitad de la longitud de onda utilizada. Por ejemplo, en elmicroscopio de luz visible, la frecuencia más alta, corresponde al color violeta,con una longitud de onda de 400 nm, razón por la cual el poder de resoluciónde un microscopio convencional es de solo 200 nm (0,2 micrómetros). En el

caso del ojo, depende además de la densidad de conos y bastones en la retina,por lo que se pueden observar diferencias en la agudeza visual de diferentesespecies o incluso entre individuos sanos de una misma especie.

Ojo humano desnudo

: 0,1 mm, desde una distancia deobservación de 30 cm.Ojo de halcón peregrino: quien sabe, pero pueden distinguirun ratón desde 2 Km de altura (tienen muchos más conos ybastones que nosotros y sus ojos son enormes encomparación con sus cabezas).

Microscopio de luz visible

: 0,2 µm

Microscopio de luz ultravioleta

: 0,1 µm

Microscopio electrónico de transmisión

: 0,1 nm

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Unidades de medida

1 m= 1metro1 mm= 1milímetro1 µm= 1 micrómetro1 nm= 1 nanómetro1Å= 1 unidad Armstrong1 m= 1.000 mm=1.000.000 µm=1.000.000.000 nm =10.000.000.000 Å1 mm= 1.000 µm = 1.000.000 nm = 10.000.000 Å1 µm= 1.000 nm = 10.000 Å1nm= 10 Å

TIPOS DE MICROSCOPIA

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada. Por ello las porciones transparentes del espécimen quedan oscuras,mientras que las superficies y partículas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan entodas las direcciones, incluida la del eje óptico que conecta el espécimen con la pupiladel observador. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicostransparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. También es bastante utilizado en la observación de muestras metalográficas para la observación de detalles en superficies con alta reflectancia .

El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Paralograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especialque ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual seobserva detrás de la muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñaspartículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.El efecto es similar a las partículas de polvoque se ven en el haz de luz emanado de unproyector de diapositivas en una habitaciónoscura. La luz reflejada por las partículas depolvo llega hasta la retina del ojo, lo que lashace visibles. La luz dispersa permite inclusodistinguir partículas más pequeñas que elpoder separador del sistema óptico usado portransparencia.Los condensadores que se emplean enMicroscopía de campo oscuro son de dostipos: del tipo paraboloide (tiene una superficie espejada), y los del tipo cardioide, condos superficies espejadas. El empleo de uno u otro es indistinto, mediante cualquierade ambos, la luz no incide directamente en el objetivo (este es el objetivo de estoscondensadores), si no que incide con una apertura numérica mayor al del objetivo.

Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para espécimenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina

Nomarski, microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC). Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseñado para observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales. DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases.

Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente coloreados.

Microscopía de fluorescencia: una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas luminosos: esto se conoce como fluorescencia. La luz fluorescente de mayor longitud de onda se observa como si viniera directamente del colorante.

El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz ultravioletaen el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda.La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por lasmoléculas que han absorbido la excitación primaria y re-emitido una luz con mayorlongitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se debencolocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa paradetectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas confluorocromos

El fenómeno de la fluorescencia se produce cuando un electrón de un átomo absorbetoda la energía de una determinada longitud de onda de la luz, saltando a otrosorbitales. Es una situación inestable durante la cual se emite la mayor parte de laenergía que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a suorbital.

Aprovechando este fenómeno, se han creado los fluorocromos. Para utilizarlosnecesitamos una bombilla que emita luz ultravioleta y luz visible. Para excitar elflurocromo necesitamos un filtro de excitación que seleccione la longitud de onda queexcita nuestro flurocromo. Los más comunes son el DAPI que tiñe el núcleo de lascélulas y el GFP. El uso actual del microscopio de fluorescencia se ve aumentado porel desarrollo de las técnicas de inmunohistoquìmica en las cuales se usan anticuerposmarcados con fluorocromos para detectarsustancias específicas dentro de las células.

MICROSCOPIO PETROGRÁFICO O DE LUZ POLARIZADA

Los microscopios de luz polarizada son microscopios a los que se les han añadidodos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra yel observador), el material que se usa para ello es un cristal de cuarzo y un cristal deNicol dejando pasar únicamente la luz que vibra en un único plano (luz polarizada).Algunos compuestos inorgánicos responden al efecto de la luz, éstos tienen un altogrado de orientación molecular (sustancias anisótropas), que hace que la luz que loatraviesa pueda hacerlo en determinados planos vibratorios atómicos. El prisma deNicol permite

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