Microscopio

1. EL MICROSCOPIO

El estudio de microorganismos precisa el uso de instrumentos que amplíen su tamaño. Existen microscopios ópticos y microscopios electrónicos. Hay dos parámetros importantes en el microscopio:

- Amplitud: Que viene determinada por los aumentos de las lentes del microscopio.-Poder de resolución: capacidad de demostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos. Cuantos más aumentos tengan las lentes de un microscopio mayor será la amplitud, cuanto menor sea el límite de resolución, mayor será el poder de resolución del microscopio.

Cuanto menor sea la longitud de onda, menor será el límite de resolución y lo mismo ocurrirá si hacemos que aumente el índice de refracción del medio, lo cual se consigue interponiendo aceite entre la muestra y el objetivo, en lugar de aire.

2. OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS

Para poder obsevar los microorganismos al microscopio hay que utilizar una serie de técnicas adecuadas a cada tipo de microscopía, teniendo en cuenta qué es lo que deseamos observar. Estas técnicas son muy distintas dependiendo de que se trate de microscopía óptica o electrónica.Preparación en fresco

Para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no esté fijado; suspendiéndolo en una gota de agua colocada en un portaobjetos, y cubriéndolo con un cubreobjetos. Tinción vital

Es una preparación en fresco en la que se utiliza una solución de colorante diluída quehace que aumente el contraste.Con este tipo de preparaciones sólo se puede observar la movilidad y la forma, para poder poner de manifiesto otras características celulares es necesario el uso de tinciones que precisan una fijación previa del microorganismo. En general conlleva las siguientes etapas: extensión, desecación, fijación, tratamiento con colorantes, desecación y observación.

La extensión se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio y desengrasado (si es de un producto biológico se denomina frotis).

La fijación, que tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante.El tratamiento con colorantes se realiza sobre microorganismos sometidos a los procesos anteriores, y puede ser de distintos tipos:Negativa: Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno. Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo y sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células.

Diferencial: Intervienen dos o más colorantes y cada uno diferencia una estructura.

Los colorantes son sustancias orgánicas capaces de teñir estructuras, generalmente orgánicas, cuando se ponen en contacto con ellas. Constan de un grupo cromóforo, que porta el color pero no tiñe, y otro auxocromo, que comunica color.La desecación ha de realizarse a temperatura ambiente, porque el uso de calor origina la cristalización del colorante.La observación al microscopio se realiza con objetivo de inmersión, con el fin de aumentar el poder de resolución y obtener una imágen correcta.3.

TECNICAS DE TINCION

Tinción negativa : Reactivo: nigrosina, tinta china, etc.

Método: Poner una gota del colorante en el portaobjetos - Extensión del microorganismo - Desecación al aire - Observación con objetivo de inmersión.

Tinción simple : Reactivo: azul de metileno, safranina, etc.

Método: Extensión - Desecación - Fijación con calor y enfriar - Cubrir con azul de metileno durante 1 ó 2 min - Lavar con agua destilada - Secar - Observación con objetivo de inmersión.

Tinciones diferenciales

Tinción de Gram

Reactivos: cristal violeta o violeta de genciana fenicados - lugol - alcohol de 96° - safranina o fucsina diluídas

Método: Extensión - Desecación - Fijación al calor y enfriar - Cristal violeta durante 2 min - Retirar el cristal violeta - Añadir inmediatamente lugol durante 1 min - Lavar hasta decoloración con alcohol y luego con agua - Teñir con safranina durante 30 s a 1 min -Lavar con agua.- Secar - Observación con objetivo de inmersión.

Tinción de esporas de Wirtz : Reactivos: verde de malaquita – safranina

Método: Extensión - Desecación - Fijación al calor y enfriar - Verde de malaquita en caliente durante 5 min - Lavar con agua - Safranina durante 1 min - Lavar con agua - Secar - Observación con objetivo de inmersión.

Tinción de ácido-alcohol resistencia de Ziehl-Neelsen

Reactivos: fucsina básica fenicada - solución de ácido-alcohol (3% de HCl en etanol de 95°) - azul de metileno

Método: Extensión - Desecación - Fijación con alcohol metílico y enfriar - Fucsina durante 5 min en caliente - Decolorar hasta desaparición del color con ácido-alcohol - Lavar con agua - Azul de metileno durante 1 min - Lavar con agua - Secar - Observación con objetivo de inmersión.

Esta tinción permite diferenciar a los microorganismos que son ácido alcohol resistentes e identifica micobacterias.

Tinción de corpúsculos metacromáticos de Loëffler

Reactivo: azul de metileno

Método: Extensión - Desecación - Fijación al calor y enfriar - Azul de metileno durante 5 min - Lavar con agua - Secar - Observación con objetivo de inmersión.

Algunos microorganismos presentan en su interior corpúsculos metacromáticos, que se tiñen más intensamente que el resto de la célula.

4. ESTERILIZACION, DESINFECCION Y CONSERVACION

Se denomina esterilización a aquellas manipulaciones que dejan al objeto o material tratado de toda forma de vida.

La esterilización puede llevarse a cabo con distintos tipos de agentes:

FísicosCalor seco: En estufa (horno Pasteur) a 180°C durante 2 ó 3 h. Calor húmedo:

En autoclave durante 15 ó 30 min, según el volumen, y a 115°C ó 121°C, según la naturaleza del material que se desee esterilizar.

Tindalización: consiste en calentamientos a 55°C y 95°C durante 30 min, varios días.Pasteurización: Es un proceso que libera al material tratado de todos los organismos patógenos, pero no lo esteriliza totalmente. El tiempo de tratamiento y la temperatura

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