Miocardiopatía Dilatada En El Ganado Holstein Rojo

Una mutación sin sentido en el gen de la atrofia óptica 3 ( OPA3) causa la miocardiopatía dilatada en el ganado Holstein Rojo.

Las miocardiopatías son trastornos degenerativos del miocardio que conducen a la insuficiencia cardíaca.Durante las últimas tres décadas se observó miocardiopatía dilatada bovina (BDCMP) a nivel mundial en el ganado de origen Holstein-Friesian. En la población bovina suizos BDCMP afecta Fleckvieh y Red Holstein razas. El corazón de los animales afectados se agranda debido a la dilatación de ambos ventrículos. Los signos clínicos son causadas por la disfunción sistólica y los individuos afectados mueren como resultado de la grave insuficiencia cardíaca. BDCMP sigue un patrón de herencia autosómico recesivo y el locus causante de la enfermedad fue localizado en el cromosoma bovino 18 (BTA18). En el presente estudio se describe la identificación exitosa de la mutación causal en el OPA3 gen localizado en BTA18 que se había informado anteriormente a causa de 3 metilglutacónico tipo aciduria III en pacientes judíos iraquíes. Hemos demostrado la evidencia genética y funcional concluyente de que la mutación sin sentido c.343C> T en el bovino OPA3 gen causa la aparición tardía de miocardiopatía dilatada en el ganado Holstein Rojo.

Las miocardiopatías son un grupo heterogéneo de enfermedades del miocardio. Una clasificación contemporánea de las miocardiopatías propuestas por Maron et al. [1] los divide en 2 grandes grupos.Cardiomiopatías primarias son enfermedades confinadas principalmente al músculo del corazón, mientras que las cardiomiopatías secundarias tienen la participación de miocardio como un componente de una enfermedad sistémica o multiorgánico.

La cardiomiopatía dilatada es la forma más común de cardiomiopatía en humanos y se clasifica en el grupo de las miocardiopatías primarias mixtas, incluyendo la enfermedad familiar de origen genético. La incidencia de miocardiopatía dilatada en el ser humano se estimó en 5.5/100, 000 casos al año y es la principal causa de trasplante cardiaco en niños [2] . La patogenia de las miocardiopatías primarias aún es poco conocido, aunque durante las últimas dos décadas se han identificado un gran número de mutaciones genéticas que proporciona importantes nuevos conocimientos sobre los mecanismos responsables de las miocardiopatías hereditarias y la etiología de las miocardiopatías primarias [3] .

Miocardiopatía dilatada bovina (BDCMP) es una enfermedad del miocardio terminal con una edad de inicio de síntomas comunes entre los 2 y 4 años, a pesar de los terneros y las vacas de mayor edad también pueden verse afectadas. Los signos clínicos son principalmente de insuficiencia cardiaca del lado derecho debido a la disfunción sistólica del músculo del corazón. La lesión característica es una cardiomegalia con dilatación auricular y ventricular y la hipertrofia. Histopatológicamente, corazones afectados muestran una mezcla de atrofia de miofibras y la hipertrofia, vacuolización de miofibras y fibrosis ( las Figs. 1 A-C) [4] , [5] y [6] . BDCMP se ha observado en todo el mundo en la población Holstein-Friesian de finales de 1970 y se remonta a un toro Holstein-Friesian factor de realización rojo, ABC Reflection Sovereign que sugiere un carácter hereditario de la enfermedad [7] , [8] y [ 9] . Más recientemente, un modo de herencia recesiva se demostró en un pedigrí especialmente diseñado para segregar BDCMP [10] . En Suiza la genética de Red Holstein fue introgresión en la población Simmental desde finales de 1960 para mejorar el rendimiento de leche. Estos cruces se denominan ahora raza Fleckvieh. BDCMP afecta exclusivamente a los animales Fleckvieh y Red Holstein [6] , [7] y [11] . La enfermedad causó considerables pérdidas económicas para la industria de carne de res en la década de 1980 y primera mitad de la década de 1990. BDCMP fue eliminado correctamente de la población Fleckvieh mediante la exclusión de toros portadores sospechosos de cría.Hoy, sin embargo, casos BDCMP siguen esporádicamente diagnostica en Suiza.

figura. 1.

Los síntomas de BDCMP. (A) Los signos clínicos de BDCMP consisten en la congestión de las venas yugulares, edema subaguda en el pecho y el secuestro de las patas delanteras (indicados con flechas). (B) Comparación entre normal (a la izquierda) y afectados BDCMP-(a la derecha) corazones. (C) tinción histológica de normal (izquierda) y BDCMP afectada (derecha) los tejidos del corazón. Hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson tinciones se presentan en la parte superior y en la parte inferior, respectivamente. En los dos carros de tejidos afectados miofibra vacuolización y miofibra variación de tamaño son visibles mientras que la fibrosis transmural se muestra en color turquesa para la tinción de Masson Trichrome.

Recientemente hemos mapeado bien el locus BDCMP a un intervalo de 1,0 Mb en BTA18 basado en el análisis de ligamiento y mapeo homocigosis combinada y una estrategia basada en la asociación . Aquí, presentamos evidencia genética y funcional concluyente, además, con el apoyo de similitudes con los datos correspondientes a un modelo inducido por ENU ratón mutante que una mutación sin sentido en elOPA3 gen causa la aparición tardía de miocardiopatía dilatada en el ganado Holstein Rojo.

2. Materiales y métodos

2.1. Aislamiento de ADN

ADN de 507 muestras de sangre se aisló utilizando un kit de Nucleon Bacc2 (GE Healthcare) o un kit de alta puro molde de PCR Purificación (Roche). Se aisló el ADN a partir de cinco muestras de miocardio embebidos en parafina y se purificó usando un DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). Además, se aislaron 42 muestras de ADN de la interfase que queda después de aislamiento de ARN a partir de tejidos del corazón utilizando el reactivo TRIZOL (Invitrogen).

2.2. La extracción de RNA y síntesis de ADNc de primera hebra

El ARN total de 42 tejidos del corazón, 9 tejidos renales, 9 los tejidos del pulmón y 9 los tejidos del hígado se extrajo usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen). Posteriormente, alícuotas de 5 g de ARN total fueron transcritas invertir utilizando un kit de primeros Strand cDNA Synthesis (GE Healthcare).

2.3. Bellas cartografía del locus BDCMP y la detección del gen fosfoproteína estimulada por vasodilatadores bovina (VASP)

Animales Swiss Fleckvieh, 25 BDCMP-afectados y 25 controles, se genotipo con 109 marcadores SNP localizados dentro de la anteriormente descritos 1.0-Mb intervalo de interés utilizando protocolos estándar[12] . Trece exones de las especies bovina VASP gen se deducen sobre la base de una comparación de un anotado secuencias de la especie bovina (GenBank: NC_007316 y NM_001038110 ) con un humano VASPcontraparte ARNm (GenBank: NM_003370 ) usando el programa de Spidey ( http://www.ncbi.nlm.nih. nih.gov / spidey / ). Los exones e intrones flanqueantes parciales se amplificaron por PCR con cebadores específicos utilizando Master Mix AmpliTaq Gold 360 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems). Los amplicones fueron tratados posteriormente con fosfatasa alcalina RAPID (Roche) y exonucleasa I (New England Biolabs) y se secuenciaron en ambas direcciones en un secuenciador capilar ABI 3730 (Applied Biosystems) utilizando el kit de Terminator Ciclismo (Applied Biosystems) BigDye ®. Los datos de secuenciación se analizaron con el software Sequencher 4,9 (Gene Codes).

2.4. Re-secuenciación del intervalo de 240 kb y el genotipado de SNP

El intervalo de 240 kb fue re-secuenciado a partir de 37 amplicones superpuestas para un animal afectado-BDCMP y un animal de control. Primers fueron diseñados utilizando el software Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/ ). Los fragmentos de PCR generados que van desde 3.000 a 11.000 pb fueron amplificados por medio de Kit de SequalPrep ™ PCR larga (Invitrogen). Contigs estaban alineados a la secuencia de referencia correspondiente de la asamblea del genoma bovino BTAU 4.0 y analizados utilizando el software Sequencher 4,9 (Gene Codes). Entre todas las variaciones de secuencia identificadas se consideraron sólo los SNPs únicas para la secuencia del animal afectado-BDCMP para análisis adicionales. Para estos efectos las muestras de ADN de 22 individuos afectados BDCMP y 22 controles, Swiss Fleckvieh (n = 12) y Simmental (n = 10), respectivamente, se genotipo.

2.5. Estructura del gen OPA3 bovina y la identificación de mutaciones

La referencia humana OPA3 mRNA variante 1 (GenBank: NM_001017989 ) y la variante 2 (GenBank:NM_025136 ) fueron utilizados en las consultas entre especies estallo busca identificar las entradas de la especie bovina a juego EST (GenBank: DV876220 , CR550769 ). En consecuencia, estas tecnologías ecológicamente racionales y de toda la secuencia del genoma escopeta anotado bovino (GenBank:NC_007316 ) se alinearon a lo humano OPA3 ARNm variantes utilizando el tipo de programa de Spidey predijo in silico las especies bovina OPA3 estructura enfundados. La secuencia de codificación de la bovina especificar OPA3 gen se confirmó empíricamente en el nivel de ADNc mediante amplificación por PCR usando AmpliTaq Master Mix Oro 360 (Applied Biosystems) y por secuenciación.

Con el fin de verificar las especies bovina OPA3 c.343C gen> T mutación 33 BDCMP-afectados y 35 animales de control de Swiss Fleckvieh se genotipo para la mutación. Productos de PCR que rodean la mutación se generaron con cebadores OPA3_v2_F 5'-CTGCAGCTCCTCCAGGTC-3 'y 5'-OPA3_v2_R CCTGAACGCACAACCTGAC-3' y posteriormente

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