Métodos de purificación de anticuerpos

MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS

La purificación de anticuerpos involucra el enriquecimiento selectivo o aislamiento específico de anticuerpos desde un suero en el caso de anticuerpos policlonales, mientras que para los anticuerpos monoclonales se realiza desde un sobrenadante de cultivo celular de hibridomas. Los métodos de purificación poseen rangos desde lo más crudo a lo altamente específico.

Clasificación

1.           Fraccionamiento físico químico: Precipitación diferencial, exclusión por tamaño o unión en fase sólida de inmunoglobulinas basada en el tamaño, carga u otras características químicas de anticuerpos en las muestras. Este método aísla un subconjunto de proteínas de la muestra que incluyen a las inmunoglobulinas.

 2.           Purificación clase específica: Unión de fase sólida de una clase particular de anticuerpos (IgG, por ejemplo) por ligandos biológicos inmovilizados (proteínas, lectinas, etc.) que tienen afinidad específica a las inmunoglobulinas. Este método purifica todos los anticuerpos de la clase objetivo sin considerar la especificidad del antígeno.

 3.           Purificación antígeno específica: Purificación por afinidad de solo aquellos anticuerpos en la muestra que se unen a un antígeno en particular a través de sus dominios específicos de unión antigénica. Este método purifica a todos los anticuerpos que se unen al antígeno sin considerar el tipo de anticuerpo o isotipo. *Monoclonales no necesitan este método dado que los anticuerpos son la única inmunoglobulina en el suero*

Existen diversas técnicas de purificación de anticuerpos, dependiendo del material de partida, el grado de pureza que se desea obtener y la aplicación o el uso que se prevea hacer de ese anticuerpo.

-Se pueden aislar selectivamente los anticuerpos de interés a partir de:

●Suero inmune: Ac. Policlonales

●Liquido Ascítico o sobrenadante de cultivo: Ac. Monoclonales

1.- Separación/purificación por fraccionamiento:

Separación de Ac en base a sus características físico-químicas.

1.1 Precipitación:

Consiste principalmente en incrementar la concentración salina ya que al aumentarla ciertas proteínas se vuelven menos solubles y precipitan. Los agentes de precipitación típicos son etanol, polietilenglicol, sales liotrópicas, esto es, anti-caotrópicas tales como sulfato de amonio y fosfato de potasio, y ácido caprílico. Típicamente, estos métodos de precipitación están proporcionando productos muy impuros a la vez que llevan tiempo y son laboriosos

[pic 1]

a.- Purificación de anticuerpos por precipitación con sulfato amónico:

-  Uno de los métodos más frecuentes.

- Consiste en la separación de anticuerpos del inmunosuero.

- Fundamento: Normalmente las proteínas solubles forman puentes de hidrógeno con las moléculas de agua a través de sus grupos polares, cuando se añaden concentraciones elevadas de iones fuertemente cargados como el amonio y el sulfato, estas compiten con las proteínas por el agua. De esta manera las proteínas (Ac) al perder su unión con las moléculas de agua disminuyen su solubilidad, lo que origina que precipiten.  

- Los Ac precipitan a bajas concentraciones de sulfato amónico producto de su alta hidrofobicidad.

- Se logra fraccionar el producto de Ig de la muestra (Todos los Ac).

- Puede utilizarse como fase previa a una purificación por afinidad ya que no es tan específico.[pic 2]

1.2 Cromatografía

b.-  de intercambio iónico (IEC):

- Se utiliza para aislar o separar las composiciones en base a su carga. Separa gracias a los grupos funcionales de las proteínas los cuales le entregan carga positiva o negativa.[pic 3]

- Fundamento: Uso de resinas cargadas positiva o negativamente para unir proteínas en función de sus cargas netas en un determinado Buffer y pH. Las columnas de intercambio aniónico contienen una fase estacionaria con una carga positiva que atrae proteínas cargadas negativamente. Las columnas de intercambio de cationes son las perlas inversas cargadas negativamente que atraen proteínas cargadas positivamente. La elución del anticuerpo objetivo se realiza cambiando el pH en la columna, lo que da como resultado un cambio o neutralización de los grupos funcionales cargados de cada proteína.

c.- de exclusión por tamaño (SEC):[pic 4]

- Permite separar anticuerpos mayores a 140 kDa de componentes con un menor peso molecular de la muestra (pequeñas proteínas y péptidos).

- Separa las proteínas más grandes de las pequeñas, ya que las moléculas más grandes viajan más rápido a través del polímero reticulado en la columna de cromatografía. Los anticuerpos grandes no encajan en los poros del polímero, mientras que los anticuerpos más pequeños sí, y tardan más en viajar a través de la columna de cromatografía, a través de su ruta menos directa.

- Se utiliza previo a una purificación por afinidad y no como un método de purificación de Ac definitivo.

d.- de quelatos metálicos (IMAC):

- Se utilizan quelatos de iones metálicos divalentes inmovilizados que se unen a proteínas o péptidos con tres o más residuos de histidina como lo son las IgGs de mamíferos.[pic 5]

2.- Purificación por afinidad:

Purificación del anticuerpo mediante la unión específica a otra molécula por la que presenta alta afinidad.[pic 6]

Permite aislar las Ig de manera:

• Clase-especifica
• Antígeno-específica

a.- Purificación Clase-específica:

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