Metodo De Purificacion Del DNA Plasmídico

Método de Purificación de DNA plasmídico.

Método: Lisis Alcalina.

Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosomal los cuales están presentes en algunas células bacterianas, levaduras y hongos. Los mismos poseen DNA de doble hebra, mayormente son circulares pero también se han encontrado plásmidos lineales. La replicación de los plásmidos es independiente de la replicación del cromosoma del huésped ya que los plásmidos poseen su propio origen de replicación. El número de copias de un plasmido en la célula es variable, todo depende del origen de replicación del que posea el mismo y su regulación. Los plàsmidos no son esenciales para el desarrollo o supervivencia de la célula pero le proveen una ventaja competitiva a las células que los poseen, dado a que los plásmidos poseen gen es que le confieren características selectivas a su huésped tales como resistencia a antibióticos, nuevas habilidades metabólicas como degradación de carbohidratos, factores de virulencia y producción de toxinas entre otros.

Los plásmidos poseen un interés singular en Ingeniería Genética por ser uno de los sistemas vectores más sencillos de usar. Un vector de clonación es un sistema que permite introducir en una célula hospedadora un fragmento de DNA que se pretende clonar; en esta célula hospedadora el vector se replica y expresa, en su caso. La molécula que resulta de la unión de un DNA vector con el DNA de interés (denominado entonces "inserto") se denomina molécula de vector recombinante.

Existen unos requerimientos básicos que un plásmido debe poseer para que sea un buen vector al aplicar su uso en la biología molecular. Debe poseer un origen de replicación, un gen para un marcador de selección (ya sea resistencia a algún antibiótico) y un lugar de clonaje múltiple (MCS). El MCS es una región donde pueden digerir varias enzimas de restricción pero solamente una vez.

Existen diversos métodos para el aislamiento de plasmidos. Las técnicas de Minipreps o mini preparaciones de plasmidos, permiten la recuperación de plasmidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las células con una base de pH alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas, ocasionando que el DNA cromosomal se desnaturalice y se separe.

Por el contrario la configuración superenrrollada del plasmido se mantiene estable

La lisis alcalina es el método mayormente utilizado para el aislamiento de plásmidos circulares provenientes de células bacterianas. Existen diversos protocolos para realizar la lisis alcalina pero todos se rigen por los siguientes pasos:

 Remover las células del medio de cultivo en caldo mediante centrifugación.

 Descartar el sobrenadante para reducir contaminación mediante fragmentos de la pared celular del huésped.

 Resuspender las células en un amortiguador que contenga Tris, EDTA y glucosa.

 Lisar las células con NaOH y SDS.

 Precipitación del DNA de plásmido mediante alcohol (etanol) y una sal (acetato de amonio).

 Enjuague del material genético con EtOH al 70%.

 Resuspender el material genético.

Con este protocolo se obtiene DNA plasmídico a partir de cultivos bacterianos a pequeña escala, mediante tratamiento con lisis alcalina y SDS. La obtención de DNA plasmídico a pequeña escala es esencial para el análisis de colonias recombinantes.

Este método explota las diferencias en las propiedades de desnaturalización entre el DNA plasmídico (que son pequeños círculos de DNA cerrados covalentemente) y el DNA cromosómico. La alcalinización con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico, provoca que la lisis celular, la desnaturalización del DNA cromosómico y de las proteínas y la liberación de los plásmidos. Los plásmidos se ven menos afectados

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