Producción reuterina

Metodología.

Reactivación de la cepa.

La reactivación de la cepa L. reuteri ATCC 53608 (Vial R-4) se realiza según el instructivo

Documentos: Formato solicitud de cepas.

Inóculo

Materiales:

Cepa en caja reactivada, 20 mL de caldo MRS, incubadora a 37 °C, asas estériles, cabina, descartador.

Procedimiento

Tomar algunas colonias de la caja e inocularlas a un caldo de 20 mL e incubar a 37 °C, 100 rpm por 18-24 h

Documentos: Formato solicitud de material, formato preparación de medios de cultivo.

Producción de biomasa

Materiales

4 caldos MRS de 50 mL, 10 puntas de 1 mL, 15 puntas de 10 mL, inóculo, frasco de desechos, 15 tubos falcon de 50 mL (centrifugar), 500 mL agua bufferada  (AB) o sln salina, micropipetas de 10 y 1 mL, 10 tubos falcon de 50 mL (guardar sobrenadante), centrifuga.

Procedimiento.

Adicionar 2 mL de inóculo a cada uno de los tres caldos MRS e incubar a 37 °C y 100 rpm por 18-24 h. Incubar también el caldo MRS sin inocular (control negativo).

Pasado el tiempo de incubación, adicionar 40 mL del medio fermentado  en un tubo falcon de 50 mL. Centrifugar a 4000 rpm por 15 min. Adicionar el sobrenadante en tubos falcon y guardar. Resuspender el pellet con ~20 mL de AB. Centrifugar a 4000 rpm por 15 min. Descartar sobrenadante. Resuspender nuevamente. Centrifugar. Descartar sobrenadante. Resuspender en 12 mL de AB. Utilizar 4 mL para cuantificar biomasa y el restante para producir reuterina. Realizar el mismo procedimiento para el control negativo.

Producción de reuterina.

Materiales: Suspensión de L. reuteri, 100 mL de solución estéril de glicerol (200 mM), 10 tubos de ensayo, 5 sobres de anaerobiosis, incubadora, puntas de 10 y 1 mL, micropipetas, caja de anaerobiosis.

Procedimiento

Solución de glicerol 200 mM: Pesar 18.4 g de glicerol puro por cada L de  solución.

Mezclar 5 mL de la suspensión de L. reuteri con 5 mL de la solución de glicerol (200 mM) en un tubo de ensayo. Incubar por 2 h a 37 °C en anaerobiosis. Centrifugar por 15 min a 4000 rpm  y guardar sobrenadante para cuantificar reuterina.

Realizar el mismo procedimiento con el pellet del MRS sin inocular.

Cuantificación de Biomasa.

Materiales: Suspensión de L. reuteri, cajas de Petri pequeñas (pre-secadas al horno y pesadas), puntas de 10 mL, AB, micropipeta de 10  mL, horno, descartador.

Procedimiento.

Adicionar 3 mL  de la suspensión en una caja de Petri. Secar a 110 °C por 4 horas.

Pesar y calcular la biomasa seca por medio de la diferencia de pesos.  

Cuantificación de reuterina.

Realizar previamente la curva de calibración.

Materiales: Sobrenadante con reuterina, solución de acroleína [¿] (control positivo), control negativo, micropipetas, puntas de 1 mL y 10 mL, HCl fumante, solución 0.01 M de Triptófano, baño de María a 37 °C, espectrofotómetro, celdas desechables, agua purificada, guantes de butilo.

Procedimiento.

1. Adicionar 0.5 mL de muestra en un tubo de ensayo
2. Adicionar 0.5 mL de agua purificada
3. Adicionar 0.75 mL de la solución de triptófano 0.01 M
4. Adicionar 3 mL de HCl fumante.
5. Incubar por 20 min a 37 °C.
6. Leer la muestra en el espectrofotómetro a 560 nm.

Si la absorbancia está por encima o por debajo del rango de la curva, tomar menor o mayor cantidad respectivamente en el primer paso.

Tener en cuenta que la suma del volumen de la muestra y el volumen de agua debe ser 1.0 mL. Por ejemplo, si en el paso 1 se adiciona 0.3 mL de muestra, se debe adicionar 0.7 mL de agua en el paso 2.

Si la absorbancia está en el rango de la recta, calcular la concentración de reuterina en la muestra:

[pic 1]

Donde:

[Reuterina]: Concentración de reuterina en la muestra (mM)

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