Técnicas Cromatográficas

Introduccón.

Uno de los problemas más grandes a la hora del estudio de compuestos biológicos es la separación y purificación de sustancias en una mezcla, para ello, se llevan a cabo métodos para poder lograrlo, uno de ellos es la cromatografía.

La cromatografía es un método de separación y purificación, basado en las diferencias de migración de los componentes de una mezcla sobre una fase estacionaria por influencia de una fase móvil. Estas dos fases se distinguen en que la fase estacionaria puede ser sólida, líquida o una mezcla sólido-líquida inmovilizada. La fase móvil puede ser líquida o gaseosa.

La selección de dichas fases se hace en función en cómo el compuesto se logra distribuir en dos fases inmiscibles.La selección realizada para utilizar cierta cromatografía se debe considerar la estructura química, propiedades físicas y químicas de los componentes de la mezcla, aunque se pueden utilizar diferentes métodos cromatográficos continuamente para lograr una óptima separación y purificación.

Se cuenta con distintos tipos de cromatografía en las que destacan:

• Cromatografía en columna: una columna para uso cromatográfico consiste en dos fases contenidas en un espacio que, generalmente, es un cilindro.
• 1.- fase sólida y líquida : el sólido se selecciona de manera que tenga afinidad química con las sustancias a cromatografía. La fase líquida es la móvil y debe ocasionar un grado de deserción si las sustancias han de verse desplazadas en la columna.
• 2.- Dos fases líquidas: Estas deben ser inmiscibles y que una se mantenga estacionaria, mientras la otra se desplaza. Esto proporciona el sistema de reparto.

• Cromatografía en papel: Basada en que el compuesto se distribuye entre dos fases líquidas. Las ventajas de la cromatografía en papel son: la gran cantidad de resolución,facilidad de detección y la simplicidad de utillaje; la cromatografía en papel es la técnica más efectiva para compuestos polares. El papel de la cromatografía contiene alrededor de un 5% de agua en condiciones de 《aire fresco》, pero puede llegar al 20% en contacto con el vapor de agua.
• Cromatografía en capa fina: En este se emplea el fenómeno de adsorción y reparto, ayuda a determinar el grado de pureza de un compuesto. Es útil como método de comparación y realizar el seguimiento de una reacción.

La clorofila es el pigmento verde en la mayoría de las plantas que están asociados con la fotosíntesis. El pigmento absorbe toda la luz de color a excepción de la banda verde, que se refleja a dar su hoja de espinaca y color característico tallo. Estos pigmentos se encuentran en el interior de la células vegetales específicamente en una organela llamada cloroplasto . Los cloroplastos son simplemente plástidos que contienen pigmentos clorofílicos. Los compuestos clorofílicos están ligados químicamente con las estructuras internas del cloroplasto (membrana tilacoides) y se hallan retenidos en estado coloidal.

 Los responsables de esta coloración son los carotenoides, son pigmentos orgánicos estos pueden clasificarse en carotenos y xantófilas. Los carotenos son carotenoides no oxigenados y las xantófilas son derivados oxigenados de los carotenos. Por lo general son de color amarillo anaranjado pigmentos que dan a las zanahorias su color característico. El beta caroteno es el pigmento principal carotenoide que se encuentra en las espinacas.

Los fenómenos rectores del proceso de retención y separación son la adsorción y la absorción.El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se refiere a la fijación o retención de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas químicas y físicas que dependen de la naturaleza de la sustancia absorbida, temperatura, naturaleza del absorbente y concentración. El segundo fenómeno determina la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezclas o reaccionar químicamente con la misma. Este último es ocasionado a la interacción del tipo dipolo-dipolo o puentes de hidrógeno entre el adsorbente y el soluto. Las moléculas de soluto se adsoben e  los centros polares de la fase estacionaria, conllevando a la elución a la par que las moléculas del disolvente son desplazadas.

La separación de los pigmentos mediante el método de cromatografía se da a través de un mecanismo de asorción física, dónde se establece el equilibrio de adsorción-desorción, la movilidad de los componentes de una muestra que se desee separar dependerá de la afinidad presentada con b la fase móvil y su polaridad (para que se realice una separación cromatográfica apta) la cual dependerá de cada pigmento y del tipo de fuerzas intermoleculares que se pueden establecer con los componentes de la fase estacionaria y la estructura del disolvente en la fase móvil. Por lo que la polaridad es directamente proporcional a la adsorción.

Objetivo.

Separar los pigmentos presentes en diversas muestras vegetales por cromatografía en papel, capa fina (TLC) y columna, para practicar, comparar y destacar la importancia de estas técnicas en la investigación bioquímica.

Tabla 5: fases móviles (eluyentes) y estacionarias empleadas en las cromatografías de la práctica y su polaridad

Tabla 6: Información literaria de los principales componentes separados de las muestras en las cromatografías

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Análisis de resultados

Cromatografía en papel

En la cromatografía de papel se corrió la muestra de hojas de espinaca empleando como fase estacionaria la celulosa (componente del papel de Whatman) que es una fase polar; y como fase móvil una mezcla de componentes (ver tabla 5) que se resumen en una fase móvil apolar.

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