TP2 curva de Calibración

Trabajo Práctico Nº2:

Métodos espectrofotométricos para la determinación de concentraciones de macromoléculas

Objetivos:

• Conocer distintos métodos de cuantificación de proteínas.
• Construir una curva de calibración mediante el método de Bradford, a partir de una proteína patrón (albúmina).
• Determinar la concentración de proteínas en una muestra incógnita aplicando la Ley de Lambert-Beer.

Introducción:

La cuantificación de proteínas es una de las determinaciones que se realiza en una determinada etapa de un ensayo. Algunas de sus aplicaciones son: medir la actividad biológica de la proteína, calcular la cantidad de enzima que debe ser agregada a un determinado sistema, etc.
Existen diversos métodos para la cuantificación de las proteínas, todos ellos basados en alguna de sus propiedades físicas y químicas. El que realizamos en éste trabajo es el método de Bradford.

El método de Bradford involucra la fijación de un colorante (Coomassie Blue) a las proteínas de manera no covalente. Este colorante se presenta en tres formas distintas (aniónica, neutra y catiónica) teniendo cada una un espectro de absorción característico, es por esto que se lo utiliza para dosar proteínas en solución. La forma aniónica es la que se fija a las proteínas, a través de los aminoácidos básicos de las mismas.

Resultados:

A partir del método de Bradford se llevó a cabo el siguiente protocolo para realizar una curva de calibración en base a Δabsorbancia, a fin de poder cuantificar proteínas de una muestra incógnita:

* 100 µl conteniendo una concentración incógnita de proteína y de solvente.
** Para construir la curva se utilizó un promedio del blanco de A= 0,177
*** Para las mediciones de las absorbancias se utilizó un espectrofotómetro de simple haz.

Con los datos obtenidos del protocolo, se obtuvo la siguiente curva de Δ absorbancia (Abs tubo - Abs blanco) vs concentración de proteína:

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