Tecnicas Inmunologicas

TECNICAS INMUNOLOGICAS: OBJETIVO Y FUNDAMENTO

INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO

La unión antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) es una interacción reversible en la que están involucrados enlaces no-covalentes. En la interacción in vitro de un antígeno (Ag) con su correspondiente anticuerpo (Ac) se distinguen dos etapas, la interacción primaria no visualizable y la INTERACCIÓN SECUNDARIA, que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparición de un fenómeno visible como la aglutinación o la precipitación. Por otro lado, no siempre que se produce la interacción primaria Ag-Ac, se produce la interacción secundaria, ya que, para conseguir fenómenos visibles, son indispensables determinadas concentraciones y características de los Ags y Acs.

INTERACCIÓN SECUNDARIA AG-AC

Las técnicas inmunológicas que evidencian la interacción Ag-Ac a través de una reacción secundaria (precipitación ó aglutinación) son, generalmente, más económicas y sencillas que aquellas que permiten visualizar la interacción primaria.

A- Reacciones de precipitación

Al mezclar cantidades suficientes de Ag soluble con Acs específicos, la interacción Ag-Ac puede dar lugar a una red capaz de ser visualizada como un precipitado. Esa red de la que hablamos, no es otra cosa que grandes complejos inmunes (CI) formados por la interacción Ag-Ac

La reacción de precipitación depende de la VALENCIA del Ac y del Ag. La valencia del Ac da idea del número de sitios que posee para reconocer al Ag. De esta manera, un Ac bivalente posee dos sitios capaces de reconocer al Ag.

Técnicas inmunológicas basadas en reacciones de precipitación.

1- Inmuno Difusión Radial (IDR)

Esta técnica permite cuantificar de manera sencilla y económica inmunoglobulinas de isotipo G, M y A ó antígenos solubles (C3, C4, transferrina, etc) presentes en muestras biológicas. La técnica se basa en la difusión de la muestra conteniendo el antígeno a medir (inmunoglobulinas ó antígenos solubles) en una matriz semisólida de agar en la que se encuentra disuelto el Ac específico. La muestra biológica se introduce en los orificios cilíndricos excavados en el agar y a medida que el antígeno difunde en forma radial, se alcanza la relación Ag-Ac que permite la formación precipitados visibles. Una vez finalizada la difusión se mide el radio (R) de los precipitados que es proporcional a la concentración de antígeno (C). La concentración de proteína en la muestra biológica (Cx) se calcula realizando una curva de calibración utilizando muestras patrones de concentración conocida.

2- Inmunoelectroforesis (IEF).

La inmunoelectroforesis es una técnica cualitativa que permite la identificación de diferentes componentes proteicos presentes en distintas muestras biológicas (suero, orina, etc) a través de arcos de precipitación. La técnica se realiza preferentemente en geles de agarosa y se distinguen dos etapas: 1) La muestras se someten a una separación electroforética y 2) Terminada la electroforesis, las proteínas son precipitadas con los Acs específicos aplicados en el agar en un canal paralelo al eje de migración. Luego de un período de difusión de los Acs, se observan arcos de precipitación cuya forma y posición dependen de las características inmunoquímicas y de la concentración de cada proteína.

B-Reacciones de aglutinación

Las reacciones de aglutinación, tal como vimos para las reacciones de precipitación, involucran una interacción secundaria entre Ag-Ac que llevará a la aparición de un aglutinado que se visualiza como grumos. Los principios fisicoquímicos que gobiernan la formación de estos aglutinados son los mismos que gobiernan la formación de un precipitado.

La ventajas de las reacciones de aglutinación desde el punto de vista de su utilidad en el laboratorio es que son muy sencillas de realizar, no requieren de ningún equipamiento para su lectura, son rápidas y fáciles de implementar. Además, presentan una mayor sensibilidad que las reacciones de precipitación por lo que las han sustituido en muchos casos. Sin embargo, cabe mencionar, que las reacciones de aglutinación presentan una menor sensibilidad que las reacciones de interacción primaria tales como ELISA e Inmunofluorescencia indirecta.

Tipos de reacciones de aglutinación según las características de las partículas aglutinantes:

De acuerdo a las características de las partículas aglutinantes, las reacciones de aglutinación pueden clasificarse en:

- reacciones de aglutinación activa; o

- reacciones de aglutinación pasiva.

Las reacciones de aglutinación directa se basan en la sensibilización de la partícula inerte con el Ag, por lo que resultan útiles para la detección y titulación de Ac en distintos fluidos biológicos. Como ejemplos, basta repasar la información brindada en la tabla anterior.

Por el contrario, las reacciones de aglutinación reversa se basan en la inmovilización del Ac (en general, se inmoviliza un anticuerpo monoclonal –AcMo-) en la superficie de la partícula inerte, siendo este tipo de reacciones particularmente útiles para la detección de Ag en distintas muestras biológicas.

Las reacciones de aglutinación activa se basan en el empleo de la partícula aglutinante como antígeno. Como ejemplos podemos mencionar:

Partícula aglutinante Reacción Utilidad diagnóstica

Glóbulos rojos Determinación de grupo sanguíneo y factor Rh

Glóbulos rojos Coombs indirecta Determinación de sensibilización por incompatibilidad Rh

Glóbulos rojos Coombs directa Determinación de eritroblastosis fetal

Bacterias (Brucella) Huddleson Búsqueda de Ac anti-Brucella en sueros humanos (banco de sangre)

Parásitos (Trypanosoma

cruzi) AD-Chagas Búsqueda de Ac anti-T. cruzi en sueros

humanos (banco de sangre)

Parásitos (Toxoplasma gondii) AD-Toxo Búsqueda de Ac anti-T. gondii en sueros humanos (banco de sangre)

Las reacciones de aglutinación pasiva se basan en el empleo de una partícula aglutinante inerte a la cual se la ha unido un antígeno. Como ejemplos podemos mencionar:

Concepto de TITULO

Ya se mencionó que las reacciones de aglutinación directa son útiles para la detección y titulación de Ac en distintos fluidos biológicos. Es importante destacar que NO es posible determinar la concentración de Ac sino que, en el mejor de los casos, será posible calcular un título de Ac. Para ello, se realiza la incubación de diluciones seriadas del suero del paciente con cantidades constantes de Ag particulado y se elige arbitrariamente como título la inversa de la máxima dilución de suero que produce aglutinación visible. En determinadas muestras en las que existe una gran cantidad de Ac es posible que a diluciones bajas (es decir, a altas concentraciones de suero) no se observe aglutinación. Este fenómeno se denomina efecto “prozona” y se debe a que en exceso de Ac se forman preferentemente complejos Ag-Ac solubles (como los formados en la zona de exceso de Ac en la curva de precipitación). En este caso, el título de Ac sigue siendo la máxima dilución de suero que produce aglutinación visible.

Partícula aglutinante Reacción Utilidad diagnóstica

Glóbulos rojos + lisado de T. cruzi HAI-Chagas Búsqueda de Ac anti-T. Cruzi en sueros humanos (banco de sangre)

Glóbulos rojos + lisado de T. gondii HAI-Toxo Búsqueda de Ac anti-T. Gondii en sueros humanos (banco de sangre)

Látex + gp120 Búsqueda de Ac anti-VIH en sueros humanos (banco de sangre)

Látex + sHBV Búsqueda de Ac anti-HBV en sueros humanos (banco de sangre)

Látex + estreptolisina O ASTO Búsqueda de Ac anti-estreptolisina O en sueros humanos (infección por estreptococo β-hemolítico)

Como se desprende de la tabla anterior, los soportes particulados para las reacciones de aglutinación indirecta pueden ser glóbulos rojos (en este caso se habla en general de “hemaglutinación”) o partículas de látex. El empleo de este tipo de partículas inertes ha permitido extender el rango de utilidad de la técnica de aglutinación a la determinación de Ac contra agentes infecciosos tales como el VIH o el HBV, e inclusive para la determinación de Ac contra moléculas solubles (estreptolisina O, proteína C reactiva, etc.).

Como paso indispensable para la preparación de este tipo de reactivos, es necesaria una etapa de incubación entre la partícula inerte y el antígeno soluble sensibilizante (en general, los Ag sensibilizantes son proteínas, aunque es posible inmovilizar hidratos de carbono), que permitirá el “pegado” del mismo a la partícula. Este procedimiento puede realizarse por simple adsorción (unión no covalente del Ag a la partícula) o por unión covalente. En la mayoría de los casos se requiere un acondicionamiento previo de la superficie de la partícula. Para el caso de los glóbulos rojos, esto se logra por incubación con ácido tánico (proceso denominado “tanado”) o con CrCl3. Una vez realizado el “pegado” del Ag a la superficie del glóbulo rojo, las partículas pueden ser fijadas con agentes químicos tales como el glutaraldehído con el objeto de darles mayor estabilidad en el tiempo y a los cambios de temperatura, lo que aumenta la vida útil del reactivo diagnóstico.

INTERACCIÓN PRIMARIA Ag-Ac

Si bien la interacción primaria Ag-Ac no es visible, existen distintos métodos que hacen posible visualizarla. La estrategia consiste en "marcar" al

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