Tinción de actina y núcleo celular por inmunofluorescencia

Tinción de actina y núcleo celular por inmunofluorescencia

Introducción

La inmunofluorescencia es una técnica utilizada para marcar blancos

determinados mediante anticuerpos unidos a un fluorocromo. Los fluorocromos

son sustancias que emiten un fotón de cierta longitud de onda cuando se les

excita a otra longitud de onda determinada.

Existen dos tipos de inmunofluorescencia:

 Directa: El anticuerpo que reconoce el blanco específico se encuentra unido

al fluorocromo.

 Indirecta: Se utilizan dos anticuerpos. El primero de ellos reconoce el

blanco (anticuerpo primario) y el segundo reconoce al primer anticuerpo y

está unido al fluorocromo (anticuerpo secundario).

La señal emitida por el fluorocromo puede ser cuantificada mediante citometría de

flujo o un scanner detector de fluorescencia, también se puede visualizar utilizando

microscopía de epifluorescencia o confocal.

Cuestionario previo

1. Mencione dos métodos (con el fundamento de cada uno) para fijar células

eucariontes.

2. ¿Qué es el DAPI?

3. Mencione 5 fluorocromos, incluyendo DAPI, con sus respectivas longitudes

de onda de excitación y emisión.

4. ¿Cómo funciona un microscopio de fluorescencia? (Partes y

funcionamiento)

Objetivos

 Observar la actina y el núcleo celular teñida con anticuerpos marcados

fluorescentemente o reactivos fluorescentes.

Materiales

1 placa de 48 pozos

Cubreobjetos para inmunofluorescencia

Portaobjetos

Medio de montaje

Paraformaldehído

Solución de lavado

Buffer de permeabilización

Buffer de bloqueo

1 micropipeta automática de 1 mL

1 micropipeta automática de 200 μL

1 micropipeta automática de 20 μL

1 anticuerpo anti-actina

1 anticuerpo acoplado a un fluorocromo (dependiendo del anticuerpo primario)

DAPI

Etanol al 70%

Barniz

Equipos

1 microscopio de epifluorescencia

Tiempo estimado de la parte experimental

Tiempo completo (una vez que se tienen las células confluentes): 6 horas +

observación en el microscopio

Tiempo desde que las células están bloqueadas: 4 horas + observación en el

microscopio

Procedimiento completo

1. Tinción

a) Cultivar las células en una placa de 48 pozos hasta llegar a confluencia.

b) Fijar las células con 200 μL de paraformaldehído al 2%. Incubar a

temperatura ambiente durante 20 minutos.

c) Lavar 4 veces con la solución de lavado (PBS/NH4Cl) empleando 200

μL/pozo.

d) Permeabilizar las células con 200 μL/pozo de buffer de permeabilización

(PBS/NH4Cl/Tritón X-100/BSA). Incubar 20 min a temperatura ambiente.

e) Lavar 4-5 veces con la solución de lavado.

f) Adicionar 300 μL/pozo de buffer de bloqueo (PBS/NH4Cl/BSA) durante 1

hora.

g) Agregar 100 μL/cubreobjeto del anticuerpo primario (anti-actina) diluido en

el buffer de bloqueo durante 60 minutos a temperatura ambiente.

h) Lavar 4-5 veces con 300 μL/cubreobjeto de la disolución de lavado.

i) Agregar 100 μL/cubreobjeto de la disolución del anticuerpo secundario +

DAPI en buffer de bloqueo durante 60 minutos a temperatura ambiente.

*La mezcla de anticuerpo y DAPI debe mantenerse protegida de la luz.

j) Lavar 4-5 veces con la solución de lavado.

2. Montaje de la muestra (dependiendo del tipo de microscopio a utilizar)

a) Etiquetar y limpiar los portaobjetos con alcohol, cuidando que no les queden

restos de papel.

b) Colocar en el portaobjetos las gotas de solución de montaje

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