ACTIVIDAD ENZIMATICA: FOSFATASA

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y ALIMENTARIAS

ACTIVIDAD ENZIMATICA: FOSFATASA

LAURA FERNANDA VALENZUELA GARCIA

 LUIS FELIPE CARDENAS PUERTA

STEIGHER DEVIA

CHRISTIAN GARCIA LOAIZA

BRAYAN LOPEZ GRISALES

LABORATORIO DE BIOQUIMICA FRANCISCO PEÑA

MEDELLIN

29/04/2016

OBJETIVOS

* Comprender la reacción básica de las fosfatasas.

* Construir una curva de calibración con el producto de la reacción, la cual será usada para calcular la cantidad de producto liberado después de la catálisis.

* Calcular los parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina mediante un sustrato sintético y el seguimiento espectrofotométrico de la aparición del producto de la reacción.

* Determinar el tipo de inhibición del fosfato sobre la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina.

INTRODUCCIÓN

En esta práctica se prepara un blanco para determinar la absorbancia de PNP, utilizando como solución diluyente el buffer de glicina y en base a las diluciones se halló sus respectivas concentraciones, formando así una curva de calibración de la fosfatasa alcalina I, Lo que posteriormente sirvió para interpolar las absorbancias con la curva de calibración que se haría posteriormente, esta última se trataba la determinación del tipo de inhibición, la cual consistía en incubar, dejar en reposo determinado tiempo, adicionando Na2HPO4 para así detener la reacción. También se construyó una tabla para determinar los parámetros enzimáticos, Km y Vm y se establece otra tabla con esta misma tabla pero en presencia del inhibidor.

MARCO TEORICO

La fosfatasa alcalina (Ortofosfórico monoéster fosfohidrolasa, (EC 3.1.3.1) es una enzima hidrolasa responsable de eliminar grupos fosfatos de varios tipos de moléculas como nucleótidos, proteínas y alcaloides mediante la hidrólisis del enlace éster fosfórico. Su actividad enzimática es óptima a un pH alcalino (entre 9 y 10) por lo que se libera fosfato al medio, la enzima propiamente necesita cofactores de iones Zn2+ para realizar su actividad, el fosfato la inhibe. [1]

Fisiológicamente hablando, la presencia de fosfatasa alcalina en el cuerpo es muy importante, se encuentra en la mayoría de los tejidos del cuerpo, mayormente en hígado, vías biliares y huesos. Cuando el cuerpo se encuentra en crecimiento, cuando se es mayor de 60 años, y en mujeres embarazadas es normal encontrar una cantidad elevada de fosfatasa alcalina en los huesos, sin embargo, en adultos ya será grave y se le denomina Hiperfosfatasemia. Sin embargo, tener cantidades bajas de fosfatasa alcalina (Hipofosfatasia) ya será una enfermedad genética metabólica de los huesos que causará fatiga, taquicardia, dificultad para respirar, intolerancia al frío, estreñimiento o pérdida de peso importante. Es la enzima más sensible a los problemas hepáticos producidos por tumores metastásicos.

Durante este laboratorio, se estudió la actividad enzimática propia mediante la utilización de un sustrato llamado p-nitrofenilfosfato (PNPP) que se hidroliza por medio de la enzima, liberando fosfato al medio y produciendo p-nitrofenol (PNP) este último producto causa una coloración amarilla, aspecto importante para cuantificar su concentración espectrofotométricamente a una absorción de λ = 410nm. Acto seguido se analiza el tipo de inhibición que representa en dicha enzima una solución de fosfato 0,5x10-2 M. Tanto en la actividad enzimática como en la determinación del tipo de inhibición se utilizó Na2HPO4 para detener la reacción.

PREGUNTAS

¿Cuál es la importancia clínica de la fosfatasa alcalina?

R//las fosfatasas alcalinas son encimas que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, particularmente alta su presencia en huesos, hígado, placenta, intestinos y riñón. Tiene importancia tanto su aumento como su disminución de los niveles en plasma.

¿en este caso, se puede considerar el fosfato como un inhibidor por producto?

R//= EL fosfato se comportó como un inhibidor de tipo competitivo 1-3

Sería posible revertir la inhibición provocada por el fosfato aumentando la concentración de pnpp?

R//=las velocidades iniciales en presencia del inhibidor disminuyen. La diferencia entre las velocidades en presencia del inhibidor se hace cada vez menores con respeto a una reacción cinética sin él. La velocidad aumenta mientras más sustrato se le adicione.

RESULTADOS

[pic 1]

2 DATOS SEGUNDA PRÁCTICA DE FOSFATASA ALCALINA

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