Actividad enzimática en fluidos biológicos: actividad de fosfatasa acida en suero
Enviado por Toyfa22 • 14 de Mayo de 2016 • Informes • 1.050 Palabras (5 Páginas) • 538 Visitas
Laboratorio N°2 de enzimología: “Actividad enzimática en fluidos biológicos: actividad de fosfatasa acida en suero”
INTRODUCCIÓN
Este trabajo se realizó sobre suero en sangre para calcular la actividad enzimática de fosfatasa acida a partir de su velocidad de reacción.
La fosfatasa acida es una lisozima celular, isoenzima del grupo de las fosfatasas acidas. Su peso molecular es de 100.000 D. Se encuentra presente en el líquido seminal1. Está ubicada principalmente en la glándula prostática y en menor proporción en el hígado, estomago, riñón, musculo, plaquetas, eritrocitos, medula ósea y bazo. Debido a esto es importante para diagnósticos clínicos de cáncer en próstata.
¿Cómo se puede determinar la actividad enzimática de la fosfatasa acida prostática? Primero se midió la fosfatasa acida total y se resto la fosfatasa acida inhibida por al L-tartrato (inhibidor especifico de la fosfatasa acida prostática).
La actividad se expresa en unidades de enzima. Considerando una unidad de enzima a la cantidad necesaria para transformar una micro moles de sustrato por minuto. Los valores de actividad total en suero para adultos normales se encuentran entre 2-11 U/L. La actividad enzimática de fosfatasa acida prostática para adultos normales se encuentra entre 2-3 U/L. Valores mayores a estos últimos (en adultos) se asocian a cáncer a la próstata.
MATERIALES Y METODOS
Equipos:
- Espectrofotómetro
- Vortex
- Baño Maria (37°)
- Pipetas
- Tubos de ensayo
- Gradillas
Reactivos:
- Sustrato: p-nitrofenol fosfato0.036M
- NaOH 0.1M
- Buffer citrato con tartrato 0.09 M Ph 4.85
- Buffer citrato sin tartrato 0.081M pH4.85
- Suero
Procedimiento:
Blanco 1 | blanco 2 | Muestra 1 | Muestra 2 | |
R Muestra 1 | R Muestra 2 | |||
PNFF | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
Buffer con T | 0,5 |
| 0,5 |
|
Buffer sin T |
| 0,5 |
| 0,5 |
Baño Maria | 5’ 37 °C | |||
Suero |
|
| 0,2 | 0,2 |
Baño Maria | 5’ 37 °C | |||
NaOH 0,1 M | 5 | 5 | 5 | 5 |
Suero | 0,2 | 0,2 |
|
|
- Llevar al Vortex.
- Calibrar el equipo en agua destilada. Leer la absorbancia a 402nm.
FUNDAMENTOS
Las fosfatasas ácidas son enzimas que en pH ácido (aproximadamente 5,0) tienen la propiedad de catalizar la hidrólisis de fosfomonoésteres, liberando como productos de la reacción fosfato inorgánico y un alcohol, cuya naturaleza depende del sustrato utilizado1.
En esta experiencia se utilizó paranitrofenolfosfato como sustrato originando como producto de la reacción p-nitrofenol y un fosfato inorgánico1, 2. Al añadir NaOH cambia el pH del medio, deteniendo la actividad de la enzima y convirtiendo p-nitrofenol en p-nitrofenolato, un compuesto amarillo que presenta una mayor absorbancia a 402nm.
La adición de L-tartrato inhibe la fosfatasa acida prostática, pero no inhibe a otras isoenzimas. La diferencia entre los dos ensayos (fosfatasa acida total y fosfatasa acida no prostática) representa el nivel de fosfatasa acida prostática en suero2.
[pic 1]
CÁLCULOS
Para hacer los cálculos se utilizó la fórmula utilizada por Navarro-Carrillo2
[pic 2]
ε: coeficiente de extinción molar, para el pnitrofenolato es 18400/cm.mol
Vt: Volumen total de la muestra (6,2mL)
Vs: Volumen de suero (0.2ML)
l: longitud de la celda (1CM)
RESULTADOS
Absorbancias:
BM1 | BM2 | M1 | MR1 | M2 | MR2 | |
Suero X congelado(A) | 0.047 | 0.048 | 0.05 | 0.05 | 0.048 | 0.061 |
Suero - Yuri (B) | 0.065 | 0.107 | 0.321 | - | 0.326 | 0.315 |
Suero – Gabriela(C) | - | - | 0.118 | 0.09 | 0.065 | 0.082 |
Promedios de absorbancias:
No prostático | Total |
X1 | X2 |
0.05 | 0.0545 |
0.321 | 0.321 |
0.104 | 0.0735 |
...