Biologia Molecular

El material genético ADN puede producir su propia replicación o puede pasar a ARNm, y éste a proteínas, esto último conocido como expresión génica. Hasta 1970 esto constituyó el dogma central de la biología molecular, fecha en la que se acusó la existencia de un ARN como material genético, el que se expresa en ADN dando lugar a proteínas.

En las células eucarióticas el DNA se encuentra en el interior del núcleo y asociado a proteínas, conjunto que constituye la cromatina.

CICLO CELULAR

Durante la fase S se produce la replicación del material genético. Un ciclo celular demora más o menos 24 hrs. Hay células que pierden este control y se dividen indefinidamente (cáncer).

Todas las células de un organismo tienen el mismo DNA, pero las células tienen funciones distintas, por lo que también debe haber un control para la expresión génica.

CRONOLOGÍA

 1928 Los experimentos de Criffil determinaron que algo en la célula es responsable de las características, hablándose de un principio transformante. Las bacterias de cepa lisa son patógenas, poseen una capa de polisacáridos y al ser inoculadas a un ratón este muere; la cepa rugosa no tiene capa de polisacáridos y no es mortal; al matar por calor la cepa lisa y mezclar con cepa rugosa viva, son mortales y en la sangre del ratón se encuentran cepas lisas.

 1944 Avery Mac Cartly y Mc Leod afirman que los ácidos nucleicos son responsables de la transformación celular. Al agregar ADNasa no hay transformación.

 1948-1950, Herchey, al infectar con virus marcados a bacterias, estos inyectan el material genético y se producen más virus.

 1954, Watson y Creek, se dilucidó la estructura de la molécula de ADN: doble cadena en que al interior está la base unidas por puentes de hidrógeno (2TA;3CG) y por interacciones hidrofóbicas, con un enlace fosfodiester 3’ de un azúcar con 5’ del azúcar siguiente. Esta molécula tiene carga negativa por el fosfato. Para organizar el DNA se le unen histonas. Las cadenas son antiparalelas. Postularon que una de las hebras servía de molde para la contraria, por lo que la replicación sería semiconservativa. Esto fue demostrado 5 años después por Meselson y Stanl (Tarea: cuál experimento).

 1964, Kornberg, descubre la primera polimerasa que permite sintetizar DNA: DNA polimerasa I o de Kornberg.

 1970, Temin, aisló la transcriptasa reversa, lo que permitió que un virus oncogénico se replicara. Con esto permitió la ingeniería genética, ya que se pueden introducir genes de una especie a otra, por ejemplo, se obtiene el mRNA mensajero de insulina y por la transcriptasa reversa se transforma en ADN, el que por medio de un vector se introduce en una bacteria, para que ésta sintetice insulina.

 1972, Nathans descubre las enzimas de restricción, las que son específicas, hasta entonces todas las nucleasas cortaban en cualquier parte.

 1980, se obtiene el primer animal transgénico: se introdujo un gen de la hormona de crecimiento de una rata en otra (huevo), incorporándose al genoma.

 1982, Cech demostró que algunos RNA actúan como enzimas: ribosimas.

 PCR: permite amplificar el DNA.

ADN. DENATURACION. ABSORBANCIA.

Al calentar DNA se rompen los puentes de hidrógeno y las hebras se separan, lo que se conoce como denaturación. Si se vuelven a juntar las cadenas bajo condiciones adecuadas se habla de renaturación.

Al agregar a una cadena otra molécula con secuencias que interaccionen, se habla de hibridización.

Existen moléculas que degradan el DNA y RNA, las endonucleasas lo hacen desde el interior, las exonucleasas, desde los extremos. Las enzimas de restricción son endonucleasas para una secuencia específica.

Las proteínas se pueden cuantificar leyendo a luz ultravioleta: 220-230 nm (unión peptídica); 280 nm (aromáticos: triptofano, fenilalanina). Los ácidos nucleicos absorben luz ultravioleta, con un máximo de absorción a 260 nm, por las bases, que son aromáticas. De esta manera se puede medir la concentración.

Ambas cadenas se mantienen unidas por puentes de hidrógeno y reacciones hidrofóbicas. Las cadenas se separan por calor.

Si el ADN es calentado por 5 minutos y se hace el espectro, se obtiene un espectro de absorción más alto que el ADN no denaturado porque las bases absorben más, lo que se conoce como efecto hipercrómico.

Si se mide la absorbancia a 260 nm pero a distintas temperaturas (curva de denaturación térmica), a cierta temperatura la absorbancia aumenta abruptamente en un 25 a 30%.

Distintos ADN aumentan la absorbancia abruptamente a distintas temperaturas dependiendo del número de puentes de hidrógeno.

La temperatura de fusión de DNA, es aquella donde el ADN está 50% denaturado.

OBTENCION DE ADN

Se obtiene la célula y se rompe (homogenización). Si es eucarionte, hay que aislar los núcleos, se obtiene su lisis, en presencia de una mezcla orgánica de alcohol isoamílico, cloroformo o fenol (denaturando las proteínas), en presencia de cloruro de sodio, porque el ADN está unido a proteínas. Al centrifugar se obtiene una fase orgánica y una acuosa; en la interfase se encuentran las proteínas denaturadas. Esto se repite hasta que en la interfase no haya proteínas. Se saca la fase acuosa y se agrega 2 veces el volumen de etanol a 20ºC; el DNA precipita (si su peso molecular es pequeño, el agua se pone turbia; si es de alto, precipita); se revuelve y se saca con una vagueta. Con este DNA se trabaja.

Las proteínas se pueden analizar separándolas haciendo pasar corriente sobre gel poliamilamida. Lo mismo se puede hacer con el DNA en un gel de agarosa; luego se agrega bromuro de etilo, que permite verlo bajo luz ultravioleta.

Las hebras de DNA si se colocan a una temperatura y concentración salina adecuadas se pueden reasociar: renaturación. Si aquí agregamos otro ácido nucleico con secuencias complementarias con el DNA se puede unir por puentes de hidrógeno. Como es otro ácido nucleico, se habla ahora de hibridización. Este ácido nucleico se puede marcar con radioactividad.

Expresión génica es la formación de RNA y proteínas. Esto debe estar muy regulado. El daño del ADN puede ser reparado. La replicación se da solo cuando la célula está proliferando.

REPLICACIÓN

En 1964 Kornberg encontró una actividad enzimática utilizando un extracto de bacterias capaz de, al agregar todos los desoxi nucleótidos radioactivos, incorporar esa radioactividad a su DNA. Así logró purificar una enzima llamada DNApolimerasa I o enzima de Kornberg. Por mucho tiempo se pensó que esa era la única responsable de duplicación.

Pero una mutante de E. Coli, con muy poca DNApol I, tenía una velocidad de replicación normal. Más tarde se aisló una DNApol II y una III. Esta última es la que interviene mayormente en la replicación. La DNApol I tiene su principal función en la reparación del ADN. De la DNApol II no se conoce muy bien su función.

Las DNA polimerasas (tanto eucariontes como procariontes) incorporan un desoxinucleósido trifosfato al extremo 3’ OH de la hebra, liberando pirofosfato; el que ingresa entra de acuerdo a la secuencia de aminoácidos de la hebra complementaria. Todas las DNA polimerasas elongan la cadena en el sentido 5’-3’, no son capaces de iniciar cadenas, solamente elongan cadenas. Por tanto necesitan una parte que sirva como molde y otra que sirva como partidor.

DNA pol I es polifuncional:

• Actividad polimerasa 5’-3’.

• Actividad exonucleasa 3’-5’: puede colocar y sacar nucleótidos, lo que le permite hacer correcciones en casos de distorsión, así se conserva la fidelidad en la replicación. Por eso no se producen tantas mutaciones.

• Actividad exonucleasa 5’-3’: esto le permite ir degradando el partidor y agregar el nucleótido correspondiente.

La DNA pol III se une al partidor y elonga la cadena; en un momento se cambia por DNA pol I, que termina el fragmento e hidroliza el partidor; tiene actividad polimerasa 5’-3’; exonucleasa 3’-5’.

Las 3 ADN pol tienen actividad correctora, pero solo la ADN pol I elimina el partidor.

Las RNA polimerasas también trabajan en el sentido 5’-3’, pero pueden formar la primera unión fosfodiester (tanto eucariontes como procariontes), iniciando así cadenas. Los sustratos de las RNA pol son los ribonucleótidos

La enzima que sintetiza el partidor es una ARN pol llamada primasa. En las células se acompleja con una helicasa (va separando las hebras). Este complejo se llama primosoma.

Al estudiar cómo se replica el ADN se encontraron intermediarios de replicación (obtenidos por Okazaki), formados por un trozo de RNA y el resto por DNA, estos se conocen como fragmentos de Okasaki. Por tanto, el partidor lo da el RNA. Pero el DNA final no tiene RNA.

La replicación comienza en una secuencia determinada llamada origen de replicación.

La E. coli tiene un solo origen y cadena circular. La replicación se inicia en un punto bien específico llamado ori C, de 245 pares de bases; en ese lugar se produce un ojo replicativo. Como la DNA pol no puede iniciar, se necesita un partidor que corresponde a un fragmento de RNA, el que será elongado por la DNApolimerasa.

En las células eucariontes, que tienen mayor cantidad de material genético y de cadena lineal, existen varios orígenes de replicación. Incluso en células embrionarias se producen divisiones en 40 min, porque hay muchos más orígenes de replicación.

Las hebras se separan

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