Biologia Molecular

Índice

1. Introducción

2. Estructura del DNA

3. Aspectos básicos de la Biología Molecular

4. Desarrollo

5. Técnica de PCR

6. Optimización de la técnica de PCR

7. Aplicaciones de la Técnica de PCR

8. Bibliografia

INTRODUCCIÓN

Para abordar de lleno el tema de la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) debemos hablar primero de Biología Molecular, esta es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de uno seres a otros y se exprese en los nuevos individuos, este conocimiento nos permite cruzar las barreras naturales que existen entre las especies y "colocar" genes de un organismo otro llamado hospedero, empleando técnicas de ingeniería genética. Gracias a este avance, se pueden producir fragmentos de ácidos nucleicos a gran escala, abriendo así las puertas a la secuenciación de los ácidos nucleicos y por ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia génica o la obtención de organismos superiores recombinantes.

Si pudiésemos regresar en el tiempo, nos encontraríamos con hechos que contribuyeron en forma decisiva en el desarrollo de la biología molecular, por ejemplo:

o En 1866 Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios de segregación y clasificación independiente de los genes.

o En 1869 Frederick Miescher, científico suizo descubre en el núcleo de las células una sustancia de carácter ácido a la que llamó nucleína.

o En los años veinte el químico alemán Robert Feulgen, utilizando una tinción específica descubrió que el DNA estaba situado en los cromosomas.

o En 1944 Avery McCleod y Mc Carty comprueban que el DNA es el portador de la información genética.

o En 1953 Watson y Crick deducen la estructura del DNA.

Este último hecho dio la pauta para nuevos descubrimientos que conducirían a lo que se llama tecnología del DNA Recombinante

Hablando específicamente de DNA según el modelo de Watson y Crick, la molécula está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos con polaridad opuesta, unidas entre sí formando una doble hélice. Cada nucleótido está formado por:

1.- Molécula de azúcar (desoxirribosa)

2.- Base orgánica nitrogenada: bases pirimídicas (Citosina, timina), bases púricas (Adenina, Guanina).

3.- Grupos fosfato.

Los nucleótidos se enlazan entre sí a través del grupo fosfato formando cadenas muy largas, quedando las bases nitrogenadas en la parte central unidas cada una al carbono 1 del azúcar formando un ángulo recto con su eje.

Las cadenas de poli nucleótido que constituyen una molécula de ADN se mantienen unidas entre sí gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias de ambas cadenas que quedan enfrentadas.

Estructura primaria del DNA

La estructura primaria viene dada por la secuencia de nucleótidos. Cuando se quiere representar la secuencia de un oligonucleótido o de un ácido nucleico, se representa mediante la terminología de cada una de las bases. Por ejemplo:

5 -ATCCCAGCCCGATTAAAGCC-3

Esta secuencia representa un oligonucleótido con veinte bases, de las cuales seis son Adenina (A), tres son Timina (T), ocho son Citosinas (C) y tres son Guanina (G).

El orden de la secuencia es muy importante, ya que en él reside la información contenida en el ácido nucleico; la orientación viene dada en el sentido 5 3 o

3 5 ; el 5 representa el extremo terminal del fosfato y el 3 el extremo final del átomo de carbono de la desoxirribosa.

Estructura secundaria del DNA

El DNA es una doble hélice antiparalela ya que el enfrentamiento entre las bases nitrogenadas es constante; la Adenina siempre se enfrenta con la timina formando dos puentes de hidrógeno y la Guanina siempre se enfrenta con la Citosina formando tres puentes de hidrógeno. Esta característica provoca que las dos cadenas sean complementarias. Las dos cadenas de la doble hélice tienen sentidos opuestos, mientras una va en sentido 5 3 y la otra lo hace en sentido 3 5.

Estructura terciaria y cuaternaria del DNA

Recordemos que la longitud de una hebra de DNA humano es de varios metros, por necesidad debe adoptar otras estructuras para poder estar en el interior de las células. Estas estructuras, terciaria y Cuaternaria, permiten el empaquetamiento del DNA formando los cromosomas. En las células eucariotas existen varios cromosomas y en los procariotas, existe un DNA empaquetado denominado pseudocromosoma.

Aspectos básicos de la Biología Molecular

La aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico de Ingeniería genética y referidas indistintamente como clonación, DNA recombinante o manipulación génica han sido la causa de pocas áreas de la biología molecular permanezcan inalteradas. Antes del desarrollo de la ingeniería genética no era posible aislar un gen concreto eucariótico en cantidades suficientes para su estudio molecular o el de su producto.

Una de las sustancias mas importantes y de participación decisiva en distintos procesos de la Biología Molecular son las enzimas; existen varias que podemos destacar:

Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleótidos del interior de la cadena. Son producidas principalemnete por bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto del DNA de doble hebra en secuencias específicas. Las endonucleasas de restricción de tipo II son las mas útiles en los métodos de DNA debido a su especificidad de secuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como para la de ruptura. Estas enzimas se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del género y a las dos o tres primeras letras e la especie del organismo de procedencia. El número señala el orden cronológico de descubrimiento de esa enzima en esa generación.

Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el nombre de palíndromes. La rotura se produce en ambas hebras de DNA siendo esta simétrica respecto al eje binario. Las endonucleasas de restricción cortan el DNA generando, bien extremos 3 o 5 de unos cuatro nucleótidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien extremos romos.

Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar DNA o RNA "in Vitro". La mayoría de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molécula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia son: DNA polimerasa I de E. Coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde RNA para convertirlo en DNA), la DNA polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq polimerasa. La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño cebador o primer complementario al DNA molde para iniciar la polimerización a partir de ese punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que añade nucleótidos exclusivamente a los extremos de las cadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2 .

Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberantes o romos), fosfatasas (eliminan el fosfato de la región 5 de los ácidos nucleicos), quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5 que han dejado las fosfatasas).

DESARROLLO DE LA TÉCNICA DE REACCION EN CADENA

DE LA POLIMERASA

En los años setenta se desarrollaron los métodos que permitieron de manera simple y relativamente rápida para determinar la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de DNA. Estos primeros intentos de secuenciar los ácidos nucleicos siguieron los pasos empleados en la secuenciación de proteínas: romper las moléculas en pequeños fragmentos, determinar su composición de bases y deducir la secuencia a partir de fragmentos solapantes. Este método resulta mas o menos sencillo para proteínas que resultan de la combinación de hasta veinte aminoácidos distintos, pero constituye un problema en el caso de los ácidos nucleicos donde la secuencia resulta de la combinación de únicamente cuatro nucleótidos diferentes.

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

En Abril de 1983, Kary Mullis dio a conocer la Técnica de reacción en cadena de la Polimerasa o PCR que es una técnica para la síntesis "in Vitro" de secuencias específicas de DNA con la cual la insuficiente cantidad de ADN ya no es un problema en los procedimientos de Biología Molécular ni en los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio de DNA.

La técnica se basa en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea amplificar.

Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas:

1ª Desnaturalización del ADN doble cadena

2ª Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras

3ª Extensión del cebador

...