Biorremediacion De Suelos Contaminados

Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos .

Introducción.

La degradación microbiana constituye el principal proceso de descontaminación natural (Prince, 1993). Este proceso se puede acelerar y/o mejorar mediante la aplicación de tecnologías de biorremediación. El crudo de petróleo se caracteriza por ser una matriz contaminante que contiene una elevada diversidad de compuestos, por lo que es un sustrato ideal para evaluar el potencial catabólico de cepas o consorcios microbianos de interés en biorremediación.

Planteamiento del problema.

La elevada complejidad de la composición del crudo de petróleo y derivados, implica la existencia de una amplia capacidad enzimática si se quiere conseguir una degradación significativa del crudo. La mayor parte de los estudios realizados se han llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con la combinación de diferentes cepas aisladas. En la mayoría de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que los alcanos son los componentes más abundantes del crudo de petróleo. No obstante en algunos casos, estas cepas tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenas alquílicas de ciertos Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (HAPs) alquilados, compuestos abundantes en el crudo.

Resultados anteriores conseguidos utilizando la cepa Pseudomonas sp. F21, aislada en medio mineral con un crudo ligero de Arabia corrobora la anterior afirmación; la cepa F21, la cual degrada todos los n-alcanos y los alcanos ramificados de bajo peso molecular (isoprenoides ligeros), también es capaz de degradar selectivamente las formas metiladas del naftaleno, fenantreno, pireno y criseno (Bayona et al., 1986; Solanas et al., 1984). Sin embargo, la cepa F21 es incapaz de utilizar los HAPs no substituidos (parentales), y por lo tanto la disminución de los alquil-HAPs se debe probablemente a la oxidación de las cadenas alquílicas, tal y como ya se ha descrito en otros degradadores de alcanos. Recientemente, se han descrito algunas cepas con la capacidad de degradar tanto HAPs de elevado peso molecular como alcanos, pero ésta, no parece que sea una norma general. De hecho los degradadores de alcanos citados habitualmente en la bibliografía generalmente no son capaces de romper el anillo aromático de los HAPs, mientras que los degradadores de HAPs generalmente no crecen con alcanos.

Por lo tanto se busca encontrar una bacteria que logre una degradación completa de los residuos de hidrocarburos en los suelos contaminados.

Justificación.

La biorremediación aplicada a emplazamientos contaminados por hidrocarburos suele conducir a resultados muy satisfactorios, todavía quedan algunos aspectos por abordar en la investigación. Aspectos relacionados con la falta de biodisponibilidad y la recalcitrancia de algunos HAPs de elevado peso molecular sugieren nuevas estrategias.

En relación a la falta de biodisponibilidad, mientras se conoce muy bien el comportamiento de los tensoactivos en medio líquido, donde se han obtenido muy buenos resultados, su comportamiento en medio sólido está sujeto a interacciones mucho más complejas y los resultados obtenidos hasta la actualidad muestran resultados contradictorios (Volkering et al. 1998).

En relación a la biodegradación de HAPs de elevado peso molecular, existe un grupo de microorganismos que ofrece muchas expectativas. Se trata de los hongos ligninolíticos cuyos exoenzimas peroxidasas y lacasas pueden oxidar estos substratos. Sin embargo, mientras que se pueden llevar a cabo la eliminación de estos substratos en medio líquido, la colonización de estos hongos en suelos contaminados ofrece ciertas dificultades. Un mejor conocimiento de los parámetros que condicionan esta colonización debería permitir su aplicación exitosa en la biorremediación de suelos con elevadas concentraciones de estos contaminantes.

Finalmente, otro aspecto necesario de discusión e investigación se refiere a los parámetros que se usan para establecer cuándo un suelo está descontaminado. En primer lugar se debería homogeneizar y controlar las metodologías de análisis de los TPH ya que pueden existir resultados muy dispares entre laboratorios. En segundo lugar, los valores absolutos de la concentración de los hidrocarburos en un suelo no debería ser el único parámetro para establecer que un suelo está descontaminado. El fenómeno de la falta de biodisponibilidad de los hidrocarburos más pesados y recalcitrantes y el seguimiento de la toxicidad deberían ser incluidos en los programas de seguimiento.

Objetivos.

1. Poner a punto de un sistema de análisis químico para la cuantificación de la biodegradación de un crudo de petróleo.

2. Estudiar la capacidad degradadora de distintos consorcios microbianos (F1AA, AM y TD) frente a un crudo de petróleo.

3. Evaluar la posible pérdida de la capacidad degradadora de los consorcios F1AA, TD y AM después de su crecimiento en medio rico LB, para su uso potencial como inóculos en biorremediación.

4. Estudiar el efecto del biotensioactivo MAT10 producido por Pseudomonas aeruginosa AT10 en la degradación de crudo de petróleo por el consorcio AM.

5. Comparar el efecto de la bioaumentación (adición de microorganismos adaptados a hidrocarburos) y la bioestimulación (adición de fertilizante como fuente de nutrientes, la estimulación con la adición de agua y volteo manual como fuente de oxigeno) en la biodegradación de hidrocarburos en suelos contaminados.

6. Definir la estrategia de biorremediación aplicable acorde a las condiciones in situ de los suelos contaminados por hidrocarburos

Marco teórico.

1.1 COMPOSICIÓN DEL CRUDO DE PETRÓLEO

1.1.1 Composición general

El crudo de petróleo se caracteriza por ser un líquido negro, viscoso y con una composición química sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos, básicamente de la familia de los hidrocarburos. Los hidrocarburos componen la familia predominante de compuestos (un 50-98% de la composición), por lo que constituyen uno de los grupos de contaminantes ambientales más importantes, tanto por su abundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos ambientales (Casellas et al., 1995). Mayoritariamente son alcanos de cadena lineal (n-alcanos o n- parafinas), alcanos ramificados (en menor cantidad), cicloalcanos (o naftenos) y cantidades variables de hidrocarburos aromáticos. La composición elemental de un crudo está condicionada por la predominancia de los compuestos tipo hidrocarburo: 84-87% de C, 11-14% de H, de 0-8% de S, y de 0-4% de O y N y metales como el níquel y el vanadio. Los principales componentes se subdividen y purifican en distintas fracciones (tabla 1.1): i) fracción saturada (n-alcanos, alcanos ramificados con cadenas alquílicas y las cicloparafinas), ii) fracción aromática (monoaromáticos, diaromáticos y hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), iii) fracción de resinas y iv) fracción de asfaltenos que son menos abundantes y consisten en compuestos más polares, pudiéndose encontra hidrocarburos heterocíclicos, hidrocarburos oxigenados y agregados de alto peso molecular.

1.1.2 Composición por familias de hidrocarburos

El estudio más detallado de los hidrocarburos de un crudo de petróleo agrupa estos compuestos en las siguientes familias: parafinas volátiles (alcanos no ramificados y ramificados, hasta C10), parafinas no volátiles (alcanos lineales y ramificados entre C10- C40), naftenos (cicloalcanos o cicloparafinas), oleofinas (alquenos) y aromáticos (monoaromáticos y poliaromáticos). En un grupo aparte residirían los componentes de las resinas y los asfaltenos

1.1.3 Composición del crudo según el origen.

La composición de un crudo varía según su localización. Habitualmente, todos los crudos de petróleo (no degradados) contienen alcanos (de cadena lineal y ramificada, de C1 a C40 aproximadamente, cicloalcanos o naftenos e hidrocarburos aromáticos. Las fracciones de punto de ebullición menor, están formadas por alcanos en todos los casos, mientras que la composición de las fracciones superiores varía según la fuente del petróleo. Se denomina crudo parafínico o ligero cuando el crudo contiene una elevada proporción de parafinas (n-alcanos y alcanos ramificados), y asfáltico o pesado si predominan naftenos (cicloalcanos), alcanos de cadena larga (C30-C45) y HAPs. Según el origen, tenemos crudos parafínicos o asfálticos (tabla 1.3)

1.2 REFINADO DEL CRUDO DE PETRÓLEO:

Para comprender la naturaleza química de los diferentes derivados del petróleo que potencialmente pueden ser contaminantes en el medio ambiente, hay que entender el proceso de refinado del crudo utilizado para la obtención de estos productos petrolíferos. El refinado pasa por un proceso de destilación, con la finalidad de eliminar el color y olor , así como también, los compuestos del azufre. Se destila a temperaturas crecientes obteniendo 4 fracciones principales: gasolina, queroseno, destilados medios (querosenos, gasoil, aceites lubricantes) y un residuo. Este residuo se destila al vacío obteniéndose otros aceites lubricantes (más pesados), ceras y parafinas y betumes asfálticos (alquitranes) (tabla 1.4 )

Durante el proceso de refinado, se eliminan componentes de la fracción asfalténica (altamente recalcitrante) lo que implica que los refinados intermedios (gasoil, fueles, querosenos y también las gasolinas) sean productos relativamente más biodegradables que los coques o alquitranes residuales.

Así pues, la composición química de la gasolina es diferente a la del gasoil debido a que se han obtenido como productos de destilación del petróleo a partir de diferentes intérvalos de temperatura (tabla 1.4). La obtención de gasolina es menos directa que la de los fueles y gasóleos, ya que en una primera fase se obtiene por destilación del crudo entre 20-180oC. Esto implica una composición de n-alcanos más ligera (C6-C11) que los fueles y gasóleos (C10-C25). En la gasolina encontramos como componentes más abundantes: n- butano, isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y dimetil hexanos, trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en menor cantidad los naftalenos, sus mono y dimetilados y heptano (de menor índice de octanaje).

Los fueles ligeros y el gasoil forman parte de la fracción intermedia de destilación en el proceso de refinado, lo que implica un rango de puntos de ebullición entre 185- 345oC, encontrando compuestos de 10 a 25 átomos de carbono, siendo los más abundantes los C15-C17. (fig.12). Su composición es de un 30% en parafinas (n-alcanos e isoprenoides), 45% de naftenos (cicloalcanos) y un 25% de aromáticos. En concreto a nivel de compuestos aromáticos encontramos alquilbencenos, y más abundantemente, el naftaleno y sus alquilados. También se ha encontrado, en cantidades menores, el fenantreno y el fluoreno. No contienen pireno ni fluoranteno (compuestos de 4 anillos aromáticos), cuyos puntos de ebullición son más elevados que el intervalo utilizado en la destilación de fracciones intermedias.

Antecedentes.

2.1 ANTECEDENTES EN EL ESTUDIO DE LA DEGRADACIÓN DE CRUDOS DE PETRÓLEO

2.1.1 Biodegradación de crudo de petróleo mediante cepas aisladas

La elevada complejidad de la composición del crudo de petróleo y derivados, implica la existencia de una amplia capacidad enzimática si se quiere conseguir una degradación significativa del crudo. La mayor parte de los estudios realizados se han llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con la combinación de diferentes cepas aisladas. En la mayoría de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que los alcanos son los componentes más abundantes del crudo de petróleo. No obstante en algunos casos, estas cepas tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenas alquílicas de ciertos HAPs alquilados, compuestos abundantes en el crudo. Resultados anteriores conseguidos en nuestro grupo de investigación utilizando la cepa Pseudomonas sp. F21, aislada en medio mineral con un crudo ligero de Arabia corrobora la anterior afirmación; la cepa F21, la cual degrada todos los n-alcanos y los alcanos ramificados de bajo peso molecular (isoprenoides ligeros), también es capaz de degradar selectivamente las formas metiladas del naftaleno, fenantreno, pireno y criseno. Sin embargo, la cepa F21 es incapaz de utilizar los HAPs no substituidos (parentales), y por lo tanto la disminución de los alquil-HAPs se debe probablemente a la oxidación de las cadenas alquílicas, tal y como ya se ha descrito en otros degradadores de alcanos. Recientemente, se han descrito algunas cepas con la capacidad de degradar tanto HAPs de elevado peso molecular como alcanos, pero ésta, no parece que sea una norma general. De hecho los degradadores de alcanos citados habitualmente en la bibliografía generalmente no son capaces de romper el anillo aromático de los HAPs, mientras que los degradadores de HAPs generalmente no crecen con alcanos

2.1.2 Biodegradación de crudo de petróleo por cultivos mixtos

La alternativa a la utilización de cepas individuales es la obtención y utilización de cultivos mixtos, los cuales pueden ser consorcios definidos y consorcios no definidos. Los consorcios definidos se caracterizan por ser una combinación de cepas aisladas con capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre sí. Los consorcios no definidos se caracterizan por ser el resultado de procesos directos de enriquecimiento a partir de muestras ambientales con historia previa de contaminación y por lo tanto no son el resultado de una combinación de cepas previamente aisladas.

2.1.2.1 Consorcios definidos

Los consorcios definidos están bien caracterizados y son repetitivos pero tienen ciertas desventajas. En primer lugar, se necesitaría un gran número de cepas distintas para conseguir una degradación extensa del crudo de petróleo, debido a la gran cantidad de componentes presentes y al espectro metabólico limitado de una cepa bacteriana. De hecho, tal y como se ha descrito anteriormente, muchos degradadores de alcanos no utilizan HAPs parentales, y entre los degradadores de HAPs, se ha descrito que, o bien degradan hidrocarburos monoaromáticos, o bien degradan HAPs de 2 a 3 anillos o de 3 a 4 anillos. Existe poca información acerca de cepas que crezcan en los HAPs alquilados de 3 o más anillos aromáticos, muy abundantes en los crudos de petróleo. Además, habitualmente no se describe una degradación significativa de la parte no resuelta por cromatografía, constituida por componentes aún no identificados. Otra desventaja que podemos encontrar en los consorcios definidos es la posible formación de metabolitos intermediarios que sean tóxicos para la misma cepa o para otras cepas existentes en el mismo. De hecho, se ha descrito que durante la degradación de mezclas de hidrocarburos se pueden formar intermediarios de persistencia y toxicidad desconocidas, por fenómenos de cometabolismo.

2.1.2.2 Consorcios no definidos

Los consorcios no definidos, especializados en la degradación de hidrocarburos, se obtienen a partir de enriquecimientos de muestras ambientales donde hayan existido episodios previos y recurrentes de contaminación por hidrocarburos. El resultado es una población microbiana seleccionada de forma natural por su cooperación metabólica en la degradación de la mezcla en cuestión, la cual potencialmente dispone de una mayor eficiencia en la degradación de compuestos conocidos y desconocidos que un consorcio definido. Por lo tanto, es más probable que en un consorcio no definido se hayan seleccionado degradadores de productos finales (dead-end products) que se acumulan como resultado de procesos cometabólicos.

2.1.3 Utilización de tensioactivos en estudios de biodegradación

Aunque una parte significativa de los hidrocarburos presentes en el medio ambiente es biodegradable, las tasas de biodegradación de los hidrocarburos en el medio ambiente están limitadas por su hidrofobicidad y baja solubilidad en agua. En consecuencia, para mejorar el proceso de biodegradación, se han desarrollado estrategias con el objetivo de incrementar la solubilidad de los compuestos hidrofóbicos mediante la adición de tensioactivos y por lo tanto aumentar la biodisponibilidad de los mismos. Los tensioactivos incrementan la dispersión/solubilización acuosa de los compuestos de baja solubilidad en varios ordenes de magnitud, disminuyen la tensión superficial del medio acuoso y además cambian la afinidad célula-hidrocarburo, al aumentar la hidrofobicidad de la superficie celular. No obstante, la biodegradación de ciertos compuestos con relativa baja solubilidad puede estar inhibida por el uso de tensioactivos como resultado de: i) toxicidad a concentraciones elevadas de tensioactivo o hidrocarburos solubilizados; ii) biodegradación del tensioactivo y no de la matriz contaminante; iii) interferencias con el proceso de transporte de hidrocarburos a nivel de la membrana celular y iv) reducción de la biodisponibilidad por exceso de micelización del contaminante

Teniendo en cuenta el uso potencial de los tensioactivos en las tecnologías de biorremediación, la utilización de los biotensioactivos parece tener más potencial que los tensioactivos de síntesis (químicos), debido a la mayor diversidad estructural, biodegradabilidad y biocompatibilidad de los biotensioactivos. Los biotensioactivos más estudiados han sido los emulsanos de Acinetobacter sp. y el grupo de ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa.

La mayor parte de estudios sobre la influencia de los biotensioactivos en la degradación microbiana de hidrocarburos se han llevado a cabo con compuestos individuales como el octadecano., fenantreno o fluoranteno. Estudios realizados con mezclas complejas, como es el caso del crudo de petróleo, son escasos, aunque la influencia de los biotensioactivos en la biodegradación de mezclas complejas supone una situación más cercana a la realidad.

Metodología y cronograma.

Investigación de teorías, realización de pruebas de laboratorio practicas aplicadas a campo. (Periodo de 1 año aprox.)

Metodología Especificaciones Periodo

Investigación de teorías. Se llevara a cavo una investigación profunda a cerca de las principales sepas bacterianas que por procesos químicos permitan la degradación de hidrocarburos mediante un sistema de control. 2 meses

Búsqueda de área (laboratorio) donde se llevaran a cavo las pruebas. Debido a la cantidad de recurso económico que conllevaría levantar un laboratorio específicamente para esta investigación, se pedirá apoyo a una organización y/o empresa para que preste instalaciones que puedan servir para realizar las pruebas correspondientes.

2 meses

Compra y adquisición de sustancias, material y equipo correspondiente. • Se adquirirá el material y equipo necesario para llevar acabo las pruebas (autoclave, cajas Petri, porta y cubre objetos, inoculadores, guantes, cubre bocas, batas, etc.)

• Se obtendrán las muestras de hidrocarburos necesarias para llevar a cavo las pruebas, de las casas comerciales que ofrezcan variedad necesaria de muestras o se tomaran de campos.

• Se adquirirán los disolventes, principalmente utilizados para procesos de extracción, serán de calidad para residuos orgánicos de la casa comercial que ofrezca mayor calidad.

• Se adquirirán todos los compuestos que se utilizaran con la mayor pureza disponible comercialmente (medios de cultivo y agua desionizada o bidesionizada).

2 meses

...