CINÉTICA ENZIMÁTICA

UNIVERSIDAD DE NARIÑO – DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PRACTICA DE BIOQUÍMICA - CINÉTICA ENZIMÁTICA

Introducción:

Una forma de medir la actividad de la catalasa, es colocarla en presencia del sustrato un tiempo determinado, luego detener la reacción por desnaturalización y finalmente cuantificar el sustrato residual. En la práctica a realizarse la acción de la enzima se detiene al agregar H2SO4 6N. La cuantificación del sustrato no transformado (residual) se medirá mediante titulación con permanganato de potasio de acuerdo a la siguiente reacción:

2 MnO4-- + 5 H2O2 + 6 H+ ------ 5O2 + 2 Mn+2 + 8 H2O

Materiales y reactivos

- Centrígufa

- Tubos de ensayo

- Tubos heparinizados

- Erlenmeyers

- Jeringas

- Pipetas graduadas

- Algodón

- KMnO4 0.002 M

- Baño 95º C

- H2SO4 6N

- Pipetas plásticas

- KCN 0.5 M

- Cronómetro

- Soporte universal

- Baño hielo

- Pinza para bureta

- Buretas

- Buffer de fosfatos:

50 mM pH 7.0, 50 mM pH 6.0, 50 mM pH 8.0

- Peróxido de Hidrógeno 0.09 M

La práctica debe realizarse a 4º C, debido al elevado número de recambio de esta enzima durante un período de 7 minutos.

Procedimiento

1. Extracto Enzimático:

En un tubo heparinizado colocar 5 ml de sangre y luego centrifugar a 5000 r.p.m. durante 5 minutos. Eliminar el plasma y lavar las células con solución salina isotónica (NaCl 0.9% w/v). Las células se lisan adicionando 4 volúmenes de agua destilada (V/V). Para el ensayo, el stock de lisis se diluye 1: 500 con buffer fosfato salino (pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0).

2. Medida de la actividad enzimática:

NOTA: Es importante recordar, que el ensayo debe realizarse a 4°C mientras la enzima esté en presencia del sustrato.

2.1 Marcar 12 tubos de ensayo como B 1, 2, 3,.......,11.

2.2 Tomar el tubo de ensayo marcado como No 3 y agregar 10 ml del extracto enzimático (dilución 1:500 pH 7.0) y calentarlo durante 10 minutos a 92ºC.

2.3 El tubo B es el Blanco por lo tanto no se agrega enzima.

2.4 Agregar en orden los reactivos, de acuerdo a la siguiente tabla:

Reactivo/Tubo B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Buffer pH 7 (ml 3 - - 3 3 3 5 4 3 2 1 0.5

Buffer pH 6 (ml - 3 - - -- - - - - - - -

Buffer pH 8 (ml - - 3 - - - - - - - - -

Sustrato H2O2 4 4 4 4 4 4 2 3 4 5 6 6.5

H2SO4 6N (ml) 1 - - - - 1 - - - - - -

KCN gotas - - - - 5 -- - - - - - -

Catalasa

Calentada (ml) - - - 1 - -- - - - - -- -

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