DETERIORO Y CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PATOGENOS DE ORIGEN ALIMENTARIO POR PCR

DETERIORO Y CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PATOGENOS DE ORIGEN ALIMENTARIO POR PCR

INTRODUCCION:

Las enfermedades transmitidas por alimentos, ocasionadas por microorganismos patógenos, constituyen un grave problema de salud pública a nivel mundial. Los métodos microbiológicos utilizados comúnmente en la detección de estos patógenos, de origen alimentario, son laboriosos y consume mucho tiempo.

Las bacterias pueden ocasionar enormes pérdidas económicas no sólo porque deterioran los productos alimenticios, sino que, además, algunas bacterias patógenas resultan extremadamente difíciles de eliminar de los alimentos, lo que origina diversas enfermedades en los consumidores.

Una de las principales fuentes de contagio con bacterias patógenas es el consumo de alimentos contaminados, entre los que se pueden mencionar pescados y mariscos, productos cárnicos y avícolas, productos lácteos, vegetales, huevos frescos e incluso la miel de abeja. Se ha demostrado que los alimentos se pueden contaminar durante su procesamiento o por el empleo de materia prima contaminada pues algunas de estas bacterias constituyen parte de la flora normal de aves, cerdos y ganado. También se ha sugerido la posibilidad de contaminación en alimentos deshidratados, debido a un manejo doméstico inadecuado.

Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA) son un problema de salud pública en todo el mundo y una causa importante de morbilidad, lo cual supone una carga económica significativa para las naciones, perjuicios para los consumidores y un impacto al comercio internacional de productos alimenticios. Más de 250 enfermedades conocidas se transmiten a través de alimentos. Su incidencia ha aumentado considerablemente durante las últimas décadas por la rápida globalización del mercado de alimentos y por los profundos cambios en los hábitos alimenticios. Además, este problema se acrecienta con el surgimiento de nuevas formas de transmisión, la aparición de grupos poblacionales vulnerables, y el aumento de la resistencia a los compuestos antimicrobianos en los microorganismos patógenos.

Se sabe que alrededor de 40 diferentes patógenos de origen alimentario causan enfermedades humanas. Más del 90% de los casos confirmados y las muertes causadas por dichos patógenos han sido atribuidos a bacterias. Entre las bacterias más comunes se encuentran: Clostridium botulinum, Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Shigella spp., Bacillus cereus, y Campylobacter jejuni. No obstante, aproximadamente el 98% de los microorganismos encontrados en los productos alimenticios no son patógenos. Por esta razón, se requiere desarrollar pruebas de diagnóstico que puedan detectar específicamente el microorganismo de interés.

La inocuidad de los alimentos es un concepto inherente a la seguridad alimentaria, y está relacionada con muchos aspectos de las tecnologías de producción agraria, a la manipulación y elaboración de alimentos, constituyendo una importante prioridad política en todo el mundo. Por lo tanto, el desarrollo y la optimización de alternativas novedosas para el seguimiento, caracterización y enumeración de patógenos en alimentos es uno de los aspectos clave en la microbiología de alimentos, y se vuelve cada vez más importante para la agricultura, la industria alimentaria y los consumidores.

Los métodos microbiológicos clásicos implican, generalmente, el uso de un apropiado cultivo de pre-enriquecimiento y enriquecimiento, el aislamiento en medios selectivos y la posterior confirmación mediante pruebas bioquímicas morfológicas y/o serológicas. Todo esto es laborioso, la obtención de resultados puede tomar días o semanas y, adicionalmente, presentan baja sensibilidad. Aun cuando a ello, se ha demostrado que algunas células bacterianas pueden entrar en un estado viable pero no cultivable (VPNC), debido al procesamiento al que se sujeta el alimento, lo que imposibilita el uso de los métodos de cultivo como herramienta de diagnóstico. Una serie de métodos moleculares alternativos, rápidos y sensibles para la detección, identificación y cuantificación de patógenos transmitidos por alimentos han sido desarrollados para superar estos inconvenientes.

En el presente trabajo se revisa la utilidad, ventajas y desventajas de la PCR como herramienta para la detección e identificación de bacterias patógenas en muestras de alimentos, así como las nuevas tendencias en el uso de estas herramientas moleculares de diagnóstico y los esfuerzos actuales tendientes a su estandarización internacional.

ANTECEDENTES:

Métodos moleculares para la detección e identificación de patógenos transmitidos por alimentos:

Los principales avances en los ensayos de detección de patógenos en alimentos, basados en ácidos nucleicos, se produjeron a partir de 1980. Los primeros métodos de identificación molecular fueron la hibridación ADN-ADN, el análisis de secuencias del ADNr 16S, la hibridación con una sonda específica y el análisis RFLP o ribotipificación. En contraste con las características fisiológicas y bioquímicas, la identificación molecular se basa en la composición constitutiva de los ácidos nucleicos más que en los productos de su expresión. Estos métodos moleculares se utilizan a menudo en asociación con la identificación microbiológica convencional.

El descubrimiento de la PCR, la clonación, la secuenciación y la tecnología de detección por fluorescencia, así como la accesibilidad a una gran cantidad de información en la web ayudó al desarrollo de nuevas herramientas moleculares, cuyo uso ha aumentado enormemente la habilidad para detectar y cuantificar bacterias patógenas en agua y alimentos, entre estas, muchas bacterias emergentes, como por ejemplo; Escherichia coli O157,Helicobacter pylori, Campylobacter spp., las cuales han representado una seria amenaza para la salud pública mundial. La segunda generación de métodos moleculares para la detección e identificación de géneros y especies son la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR múltiple, la secuenciación de genes específicos, el análisis de restricción del ADN ribosomal amplificado, entre otros.

Recientemente, se ha dado un paso hacia las plataformas moleculares más sofisticadas para la identificación de microorganismos patógenos, incluyendo sistemas de amplificación in vitro en tiempo real, biosensores y microarreglos, los cuales han sido desarrollados o se están desarrollando para su uso como métodos rápidos en la detección de patógenos en alimentos. Algunos de los actuales métodos de detección molecular pueden ser empleados, además, en laboratorios o establecimientos clínicos, en sitios de observación, tales como la granja o el campo, en forma de kit todo en uno.

Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos:

Aunque menos desarrollada que la PCR, hay una serie de reportes en la literatura sobre los ensayos de amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), incluyendo algunos que utilizan la metodología de tiempo real, para detectar ARNm de patógenos asociados a alimentos . Otros informes sobre el uso de esta tecnología para la detección de patógenos en alimentos se prevén con mucho interés, debido a su capacidad para detectar organismos viables.

Sin embargo, en un trabajo realizado por Rodríguez (2004)  la sensibilidad del ensayo NASBA a tiempo real fue pobre, durante la detección de Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis (MAP) en muestras de leche artificialmente inoculadas. Se requirió más de 5×103 células, y la reacción tampoco diferenció el ARN del ADN, reduciendo así la ventaja principal del NASBA para la detección de células vivas solamente.

Electroforesis en gel de campo pulsado:

La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) se ha utilizado para la caracterización de Salmonella, Listeria y otros patógenos de transmisión alimentaria.

Esta técnica se ha utilizado satisfactoriamente en la tipificación de Salmonella, aislada a partir de alimentos de origen animal y pacientes humanos. La PFGE también ha sido extensamente utilizada a nivel mundial para la vigilancia e investigación de los brotes de E. coli O157:H7, el trazado de las vías de transmisión y el rastreo de las fuentes de brotes de restaurantes, granjas, aguas contaminadas, animales, humanos, y/o equipos.

Un ejemplo de la utilidad de las técnicas moleculares, durante la investigación epidemiológica, se puede evidenciar en diversos brotes de ETA que por asociación estadística llegan a ser significativos cuando se utilizan estas técnicas.

Biosensores:

Varios métodos basados en biosensores se han aplicado exitosamente en la detección de patógenos alimentarios. Estos sensores se han desarrollado utilizando ADN, técnicas inmunológicas y péptidos de fagos.

El uso de biosensores en un estudio demostró que la Escherichia coli y Salmonella podrían detectarse en leche descremada, con límites de detección de 25 y 23 UFC/mL respectivamente. El ensayo se llevó a cabo en un tiempo menor a 1 h. Los biosensores ópticos que utilizan una señal fluorescente son con frecuencia los más comunes. Sin embargo, los biosensores que utilizan transductores distintos a los ópticos se han desarrollado para la detección específica de Salmonella. Olsen et al., (2006)  utilizaron bacteriófagos específicos para Salmonella typhimurium. En este biosensor, la captura de las bacterias por parte de bacteriófagos adsorbidos a un transductor piezoeléctrico dio lugar a un cambio de frecuencia en la resonancia, la cual fue medida con un dispositivo de onda acústica. Maxtek et al., (2005)  utilizaron un anticuerpo enlazado a la superficie de un cristal de cuarzo recubierto con oro, con un electrodo de oro como biosensor. Después de la captura de Salmonella, los cambios en la impedancia de alta frecuencia fueron directamente relacionados con el número de células de Salmonella capturadas. Pathirana et al., (2000)  y Kim et al., (2003) también utilizaron un análisis de impedancia similar para crear biosensores útiles en la detección de Salmonella typhimurium. Por otro lado Farabullini et al., (2007) utilizaron sensores electroquímicos para la detección rápida de diferentes bacterias patógenas transmitidas por alimentos (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, y Staphylococcus aureus).

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