CUANTIFICACION DE BKV ADN PCR

1. OBJETIVO

Detectar cuantitativamente el ADN del virus BK mediante la técnica de PCR en tiempo real, con un control simultáneo de la reacción de amplificación/extracción a través de un Control Interno (IC).

1. ALCANCE

Este método ha sido desarrollado para detección cuantitativa de ADN de BKV en plasma y orina humanos utilizando un Termociclador CFX96 Biorad. 

Intervalo de trabajo: 1.2 copias/µl A 250000 copias/µl.

1. REFERENCIAS NORMATIVAS / BIBLIOGRÁFICAS

• INS BKVDNAQT.CE /esp. BKV DNA QUANTITATION (QT) PCR en tiempo real para la cuantificación del genoma del virus BK (VBK) - Uso exclusivo para diagnóstico “in vitro”-

1. RESPONSABILIDADES

• El jefe de Laboratorio de Biología Molecular es el encargado de supervisar y verificar  este procedimiento se cumpla.
• El analista es responsable de la ejecución de este procedimiento.

1. DEFINICIONES

El poliomavirus BK humano (Polyomavirus hominis 1) pertenece al género Polyomaviridae, que son virus de ADN no encapsulado que contienen ADN de cadena doble circular de 5 Kb aproximadamente.

La infección por el virus BK se produce durante los primeros años de infancia. Es asintomática o se asocia con fiebre y síntomas leves de las vías respiratorias superiores. Hasta el 90% de los adultos son seropositivos. Tras la infección primaria, el virus BK entra en estado latente y reside en las células uroepiteliales y posiblemente en linfocitos. El virus permanece inactivo a menos que se imponga un estado natural o iatrogénico de inmunosupresión. Se ha detectado la presencia del VBK en la orina de mujeres embarazadas y ancianos. La presencia del virus también se detecta frecuentemente en la población con VIH/SIDA. La mayor incidencia de la presencia del virus ocurre en pacientes con

transplante de órgano sólido y de médula ósea.

1. DESARROLLO

Principio

El ADN de VBK, recuperado de una muestra biológica en investigación en una fase de extracción, se amplifica utilizando un sistema de amplificación en tiempo real. El producto amplificado se detecta y se cuantifica comparándolo con la curva estándar, utilizando una sonda con tinte indicador fluorescente específica para una secuencia genómica única del VBK.

El Control Interno (IC) sirve como control de amplificación/extracción para cada muestra procesada individualmente con el fin de identificar inhibidores de la reacción. Se suministra una curva estándar externa que permite la determinación de la carga viral.

1. Medidas de Seguridad

• Todo el personal que participe en la realización de los ensayos deberá llevar la indumentaria protectora adecuada del laboratorio, guantes sin polvo y gafas.
• Evitar el uso de objetos cortantes (cuchillas) o punzantes (agujas). El personal debe ser adiestrado en procedimientos de bioseguridad.
• El personal técnico debe tener una amplia formación en el uso de termocicladores Real-Time, en la manipulación de reactivos para biología molecular y en los protocolos de amplificación de PCR en tiempo real.
• Los componentes A y B son sensibles a la luz. Protegerlos de la exposición a la luz intensa.
• Tratar todas las muestras como potencialmente infectivas. Las muestras de suero/sangre/plasma humano deben ser manipuladas al nivel 2 de bioseguridad.

1. Primeros Auxilios

• Las salpicaduras en los ojos deben ser irrigadas con abundante agua del grifo e inmediatamente tratadas por un especialista

6.3  DESCRIPCION

1. Equipos y Materiales

• Micropipetas calibradas (0,5 µl < volumen < 1000 µl)
• Equipo de extracción de ADN
• Bloque térmico
• Microcentrífuga
• Racks para tubos
• Puntas filtradas estériles con barrera contra aerosoles
• Microtubos libres de nucleasa
• Microtubos de 0,2 ml recomendados por los fabricantes de los instrumentos PCR en tiempo real
• 10. Guantes desechables, sin polvo
• 11. Termociclador Real-Time PCR (*)
• 12. Papel absorbente.
• 13. Vórtex o similar.
• Cabinas de Flujo Laminar.

1. Reactivos y Soluciones

• Agua grado PCR.
• MG EtOH
• Kit para Cuantificación de BKV Marca DIA.PRO que contiene:

1. Operaciones Previas

1. Limpieza de los equipos, superficies de trabajo y materiales

• La limpieza de los equipos, superficies de trabajo y materiales a ser usados durante el desarrollo del presente protocolo, se realizara en acuerdo a lo descrito en el procedimiento de Limpieza de Material P-LBM-001.
• La evidencia de estas limpiezas serán registradas en el R-LBM-001

1. Verificación de las Pipetas

• Las micropipetas deben estar calibradas para dispensar correctamente el volumen requerido en el ensayo según el procedimiento de verificación y calibración interna del mismo IT-LBM-002 y al DE-LBM-002.
• Los datos de estas verificaciones serán registrados en el R-LBM-002 Verificación de pipetas.

1. Preparación de los componentes del Kit para Cuantificación de BKV

• Mezcla maestra: Componente A: Mezclar bien con un vortex antes de usar y centrifugar brevemente para recoger el volumen completo

• Cebadores y sondas: Componente B: Centrifugar el vial durante 1 minuto a 11000 rpm. Abrir con cuidad la tapa del vial evitando la dispersión del polvo. Disolver de forma homogénea el componente B  liofilizado con volumen de componente C  indicado en la etiqueta del vial. Mantener la disolución en la parte superior de la mesa de trabajo durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente 15°C

• Control interno: IC: centrifugar el vial durante 1 minuto a 11000 rpm. Abrir con cuidado la tapa del vial evitando dispersión del polvo. Disolver de forma homogénea el IC liofilizado con el volumen del componente C indicado en la etiqueta del vial. Mantener la disolución al menos 10 minutos a temperatura ambiente. Mezclar brevemente con un vortex.

• Curva estándar: STD: centrifugar el vial durante 1 minuto a 11000 rpm, abrir con cuidado la tapá evitando la dispersión del polvo. Disolver de forma homogénea el  STD liofilizado con el volumen del componente C indicado en la etiqueta del vial. Mantener la disolución al menos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Mezclar con un vortex. Preparar 4 tubos libres de nucleasa para la preparación de la curva estándar. Establecer diluciones 1:10 para obtener los puntos de la curva:

1. Preparación de la muestra.

Para la Recolección, identificación, manipulación, preservación y almacenamiento de las muestras, ver el procedimiento P-LBM-003

Las muestras son registradas en el R-LBM-003

1. Extracción de ADN

• Para la extracción, identificación, preservación y almacenamiento del ADN de las  muestras ver el procedimiento P-LBM-004.

1. Amplificación Y Detección.

1. Preparación de la mezcla de amplificación ( IC como control de amplificación)

• La mezcla de amplificación se prepara según los valores de la tabla teniendo en cuenta que el volumen  total de mezcla  es de 15 ul por reacción. Por tanto deberán hacerse los cálculos de acuerdo al número de reacciones.

...