DETERMINACION DE AMINOACIDOS DEL GRUPO ALFA AMINO LIBRE. Metodo de Sanger.
Enviado por AARON GALAVIZ • 20 de Septiembre de 2016 • Informes • 396 Palabras (2 Páginas) • 1.320 Visitas
DETERMINACION DE AMINOACIDOS DEL GRUPO ALFA AMINO LIBRE
METODO DE SANGER
INTRODUCCIÓN
La hemoglobina es una proteína globular constituida por cuatro subunidades proteicas. En 1943 Frederick Sanger comenzó a trabajar en la secuenciación de proteínas marcando los grupos amino libres como los correspondientes al segmento N-terminal.
OBJETIVOS
Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el método de Sanger.
DESCRIPCIÓN
La metodología de Sanger consta de cuatro pasos clave
a) Dinitrofenilación de la proteína
b) eliminación del DNFB
c) hidrólisis de la proteína
d) purificación por cromatografía.
En la reacción de Dinitrofenilación se observó una coloración amarilla un poco tenue que después se volvió más intensa ya que se aplico HCl concentrado con 15 libras/pulg2 a 120ºC, posteriormente se retiró los residuos de DNFB que no reaccionó con éter que fue evaporado por calentamiento para después colocarlo en la cromatografía.
RESULTADOS
Se realizó la cromatografía por corrimiento en papel:[pic 4]
Se procedió a realizar el cálculo de los Rf de los reactivos empleados para la cromatografía y se relacionaron con Rf de referencias bibliográficas.
Reactivo | Rf Experimental | Rf Referencia 1 | Rf Referencia 2 | Rf Referencia 3 |
DNP-Ala | 0.5516 | 0.53 | 0.50 | 0.41 |
DNP-Val | 0.6871 | 0.58 | 0.66 | 0.47 |
DNP-Phe | 0.5677 | 0.33 | 0.69 | 0.28 |
DNFB | 0.571 | 0.53 | ||
Problema | 0.6774 | -------- | -------- | -------- |
Cálculos
Discusiones
Se utilizó el DNFB que en condiciones alcalinas usando el NaHCO3, forma un derivado de color amarillo con los grupo N-amino terminales, posteriormente se detiene la reacción con HCl 3 N. Se hacen lavados con éter el cual remueve el exceso de DNFB sin reaccionar usando FeSO4 para evitar una volatilización. Posteriormente se hace una hidrólisis utilizando HCl 6 N a 15 libras/pulg2 a 120 ºC provocando que se rompan los encales peptídicos de la proteína, el aminoácido N-terminal retiene su marca y se realiza una cromatografía. El Rf experimental no concordó con el teórico, probablemente porque las extracciones no se hayan hecho adecuadamente o el calor usado para evaporar el éter haya afectado la estructura del compuesto problema, sin embargo utilizando los resultados experimentales y comparándolos entre si se deduce que el reactivo problema contiene vallina ya que los resultados son muy similares entre sí.
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