Práctica No. 1: Determinación De Aminoácidos Terminales Con Grupo Alfa Amino Libre, Método De Sanger.

INTRODUCCIÓN

Frederick Sanger, comenzó a trabajar en la secuenciación de proteínas en 1943, sus primeros experimentos se dirigían a diseñar un método para cuantificar los grupos amino libres correspondientes al segmento α-N-terminal de un polipeptido.

Sanger utilizo un reactivo llamado 2,4-dinitrofluorobenceno, que forma un derivado dinitrofenilo (DNP) de coloración amarilla con los grupos amino terminales sin cortar ningún enlace peptidico.

Cuando la proteína se hidroliza empleando HClCON, para cortar los enlaces peptidicos, el α-N-terminal retiene su marca y puede identificarse separando los productos mediante una cromatografía. Sanger observo que algunos DPN derivados de los aminoácidos como el triptófano eran inestables frente a la hidrólisis y también podía alterar otros como la tirosina y la cisteína, por lo que este paso debe acortarse alcalinizando el medio.

Para el estudio de esta tecnica, Sanger eligio a la Insulina, ya que era una de las proteinas más pequeñas conteniendo 51 aminoacidos en dos cadenas polipeptidicas (21 en la secuencia A Y 30 en la secuencia B), la publicacion de la secuencia de insulina en 1955 convencio a los escépticos de que cada proteina tiene una secuencia unica de aminoacidos.

OBJETIVO

Emplear el método de Sanger para la identificar los aminoácidos que contiene el grupo α-N-terminal de las cadenas de la molécula de la hemoglobina.

RESULTADOS

MUESTRA VALOR DE rf

DNP-Glu 0.71

DNP-Phe 0.59

DNP-Val 0.72

DNFB 0.47

Problema 0.72

DISCUSIONES

En base a lo realizado en la práctica, la reacción de Sanger nos ayudo a identificar el grupo α-amino terminal de la hemoglobina, poniendo en evidencia la coloración amarilla característica de esta prueba, esto gracias a un proceso intermedio llamado Dinitrofenilacion, que es la adición de el grupo Dinitrofenil (DNP) al amino terminal de la proteína, es una reacción no polar, por lo que fue necesario adicionar HCl, para hidrolizar el DNP de la proteína.

El proceso de identificación, consto en una cromatografía en papel, colocando en el, cada uno de los derivados dinitrofenilados de los aminoácidos tipo DNP-Phe, DNP-Asp, DNP-Val, DNFB (Solución problema), notando gran similitud entre la solución problema y la solución tipo de la Valina.

CONCLUSIÓNES

Se comprobó experimentalmente por

...