DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES EN MUESTRAS DE MIEL MEDIANTE EL ENSAYO DE FOLIN-CIOCALTEAU

DETERMINACIÓN DE FENOLES TOTALES EN MUESTRAS DE MIEL MEDIANTE EL ENSAYO DE FOLIN-CIOCALTEAU

INTRODUCCIÓN

El balance redox ha sido reconocido como un componente crítico del proceso de envejecimiento; la iniciación y desarrollo de enfermedades de notable morbilidad y mortalidad y respuestas celulares, inducidas por el estrés oxidativo. Estrechamente vinculado con el estrés oxidativo está la generación de especies reactivas de oxígeno las cuales provocan daño celular directo (1). La importancia de estudiar sustancias antioxidantes es la base de nuestro estudio en la determinación de los fenoles totales en muestras de miel.

La miel es una compleja mezcla de carbohidratos y de compuestos minoritarios, producidos en la naturaleza. Los azúcares y el agua representan los componentes químicos principales de la miel, mientras que los compuestos fenólicos con actividad antioxidante representan la parte minoritaria en su composición (2). La determinación de los compuestos fenólicos se realizará mediante el método colorimétrico que utiliza el reactivo de Folin-Ciocalteau, utilizando una curva de calibrado de ácido gálico como estándar.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Preparación de los extractos de miel

Los extractos fueron obtenidos a partir de 50 g de miel, los cuales se disolvieron en 250 mL de agua pH 2 y posteriormente se llevaron a una columna de Amberlita XAD-2 donde se lava con agua destilada y eluye con metanol puro. La fracción metanólica es llevada a rotavapor a 45°C y el residuo resuspendido en 4 mL de metanol, solución que finalmente es filtrada para eliminar impurezas.

2. Determinación de los fenoles totales

Materiales

1. Reactivo de Folin-Ciocalteau

Corresponde a una solución diluida (1:10) la cual se prepara colocando 5mL del reactivo de Folin-Ciocalteau en un matraz de aforo de 50 mL y aforando hasta su capacidad con agua miliQ. El matraz luego se cubre con papel aluminio y se lleva a refrigerador a temperatura constante.

2. Carbonato de Sodio 7,5% Corresponde al medio de la reacción y se prepara colocando lo más cercano a 7,5 g de la sal en un matraz de aforo de 100 mL y aforando a su capacidad. Para homogenizar la solución se utilizó un agitador magnético.

3. Solución Madre de ácido gálico Para su preparación se pesaron alrededor de 0,03g de ácido gálico se llevaron a un matraz de aforo de 50 mL y se aforó con agua miliQ. Para homogenizar la solución se utilizó un agitador magnético.

La determinación de los fenoles totales se llevó a cabo utilizando el método colorimétrico que utiliza el reactivo de Folin-Ciocalteau (FC), según Singleton et al, (1990) (3), utilizando una curva de calibrado de ácido gálico como estándar.

El reactivo de FC es una disolución formada por una mezcla de ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico (H3PMo12O40) que en medio básico se reducen, oxidando compuestos fenólicos de una mezcla compleja. El producto de esta reacción redox es un complejo azul Mo-W, cuya absorbancia puede medirse por espectrofotometría UV-visible (4).

Para la elaboración de la curva de calibrado (5-50µM) se elaboraron (en triplicado) tubos de ensayo bajo las siguientes especificaciones:

Tubo Agua MiliQ (µL) Ácido Gálico (µL) Reactivo de FC Sln. Carbonato de Sodio al 7,5% (µL)

1 (50 µM ) 431 69 2500 2000

2 (40 µM) 444,8 55,2 2500 2000

3 (30 µM) 458,6 41,4 2500 2000

4 (20 µM) 472,4 27,6 2500 2000

5 (10 µM) 486,2 13,8 2500 2000

6 (5 µM) 493,1 6,9 2500 2000

Tabla 1: Especificaciones para preparación de tubos para la elaboración de Curva de Calibrado de Ácido Gálico.

La preparación de los tubos se lleva a cabo agregando inicialmente el agua miliQ, luego la solución madre de ácido gálico (o dilución según corresponda), el reactivo de FC, luego del cual se lleva a sombra entre 5 a 8 minutos, finalmente se agrega el carbonato de sodio al 7,5% para dar paso a un reposo de 1 hora en oscuridad y permitir que ocurra la reacción.

Una vez transcurrido el tiempo de reacción se midió la absorbancia a  = 760 nm, y teniendo los valores de los triplicados de cada solución y con el promedio de ellos, se realizó la curva de calibrado.

Para las muestras se procedió básicamente de la misma forma, se prepararon las muestras usando el reactivo de FC en medio de Na2CO3 al 7,5% y llevando a un volumen final de 5000 µL con agua miliQ, dicha solución se dejó reposar por una hora en oscuridad y luego se midieron las absorbancias en triplicado por espectrofotometría UV-visible, las cuales fueron comparadas con la curva de ácido gálico. Los resultados se expresaron en mg de equivalente de ácido gálico (GAE)/100g miel.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Curva

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