DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DESHIDROGENASA POR EL MÉTODO DE TREVORS et al. (1982) MODIFICADO POR GARCÍA et al. (1993)

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DESHIDROGENASA POR EL MÉTODO DE TREVORS et al. (1982) MODIFICADO POR GARCÍA et al. (1993)

Principio del método

El método se basa en la estimación del iodonitrotetrazolio formazán (INTF) formado cuando el suelo es incubado con 2-p-iodofenil-3-pnitrofenil- 5-feniltetrazolio (INT) durante 20 h a 20 °C, en oscuridad.

[pic 1]

Materiales y aparatos

• Baño de ultrasonidos (no estrictamente necesario, pero conveniente).

• Agitador magnético.

• Espectrofotómetro.

• Utillaje de uso normal en el laboratorio.

Reactivos y disoluciones

• 2-p-iodofenil-3-p-nitrofenil-5-feniltetrazolio (INT) 0,4 %: Pesar 0,2 g de INT, pasarlos a un matraz de 50 ml de color topacio, añadir agua hasta que el volumen sea cercano a 45 ml y mezclar bien. Esta cantidad de INT está cercana al límite de su solubilidad en agua (Trevors, 1984b), por lo que es conveniente someter la mezcla a ultrasonidos (en un baño de los utilizados para limpieza) durante 2-3 h, agitando de vez en cuando y teniendo precaución de que no se caliente demasiado para evitar una posible reducción abiótica del INT. Una vez disuelto enrasar el matraz con agua destilada. Conservar a 4 °C en oscuridad, hasta un máximo de 1 mes. En el caso de no disponer de un baño de ultrasonidos, la suspensión de INT en agua se puede mantener en agitación durante una noche (unas 16 horas) y enrasar una vez transcurrido ese tiempo. En el momento de realizar la adición del INT a los suelos es conveniente mantener la suspensión en agitación continua, con agitador magnético, para evitar que la cantidad de INT añadido a cada una de las muestras sea diferente.
• Metanol.
• Iodonitrotetrazolio formazán (INTF) 60 μg ml-1: Disolver 0,0150 g de INTF en aproximadamente 200 ml de metanol y enrasar a 250 ml con el mismo solvente. Almacenar a temperatura ambiente, en oscuridad y perfectamente tapado.

Procedimiento

• Pesar 1 g de suelo húmedo (< 2 mm) y añadir la cantidad de agua necesaria para llevarlo al 60% de la capacidad de campo (hay que tener en cuenta los 0,2 ml de disolución acuosa que se añadirán posteriormente con el INT) y colocarlo en un vaso de precipitados de 50 ml o un recipiente similar, pero evitando el uso de material plástico.
• Añadir 0,2 ml de INT al 0,4% y tapar con doble capa de Parafilm.
• Incubar durante 20 h a 20 °C en completa oscuridad, ya que la luz reduce el INT.
• Añadir la cantidad de metanol necesaria para llevar el volúmen total de líquidos añadidos a 10 ml y agitar enérgicamente, utilizando un agitador magnético, durante 2 minutos.
• Filtrar y tapar para que no se evapore el metanol.
• Medir los filtrados en un espectrofotómetro a 490 nm frente a un blanco de calibración de metanol.
• Calcular la cantidad de INTF formado (C) por referencia a una curva de calibración que contenga entre 0 y 60 μg ml-1 de INTF. Para preparar esta curva, tomar alícuotas de cantidades crecientes, entre 0 y 10 ml, de una disolución de INTF de 60 μg ml-1 y completar el volumen de cada uno de los patrones hasta 10 ml con metanol midiendo, a continuación, a 490 nm frente al blanco de metanol.Es necesario preparar controles para cada suelo, es decir, suelo incubado sin el sustrato, a fin de poder sustraer a la absorbancia de las muestras la no debida al INTF formado por acción de la deshidrogenasa y provocada por sustancias coloreadas procedentes del propio suelo. Los controles se preparan de la misma forma que las muestras, pero añadiendo 0,2 ml de agua destilada en vez de los 0,2 ml de INT 0,4%.

Cálculos[pic 2]

Dónde:

AE = Actividad deshidrogenasa (μmoles INTF formado g-1 h-1)

C = cantidad de INTF de la muestra, en μg ml-1

Pm = peso molecular del INTF (471,3)

V = factor de dilución; en este caso 10 ml

G = factor relativo al peso de suelo seco utilizado (1/peso de suelo seco en 1 g de suelo húmedo, en este caso)

T = factor de tiempo; en este caso 1/20 h

...