Espectrofotometría

Espectrofotometría:

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más utilizado en investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar las longitudes de onda (radiación) absorbidas o transmitidas por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiende una cantidad conocida de la misma sustancia.

Todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aún el vidrio que parece ser completamente transparente absorbe longitudes de onda que pertenecen al espectro visible. El agua absorbe en la región del infrarrojo.

La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica para cada sustancia química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida; la energía radiante no puede producir ningún efecto sin ser absorbida.

El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y sólo dejan pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbidas.

La radiación electromagnética es una forma de energía radiante que se propaga en forma de ondas. En este fenómeno ondulatorio se define:

Longitud de onda (λ): Como la distancia entre dos máximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio. Se expresa en nanómetros (nm).

Frecuencia (v): Es el número de ciclos por segundo. Su fórmula es: v=c/λ y se mide en ciclos por segundo o hertzios (Hz).

Fotones: La luz está formada por fotones, que son paquetes discontinuos de energía. La energía (E) de un fotón depende de la frecuencia y de la longitud de onda, según la expresión E= hv; donde h es la constate de Planck= 6.62x10-27 erg/seg. La energía electromagnética se mide en Ergio. La relación entre longitud de onda y energía es inversa, por lo que a menor longitud de onda mayor energía y viceversa.

Espectro electromagnético: cubre un amplio intervalo de energía radiante, desde los rayos gamma de longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias regiones, las más importantes para el tema de estudio del espectrofotómetro son:

Región ultravioleta: λ= 10-380 nm

Región visible: λ=380-780 nm

Región infrarroja: λ=780-30,000 nm

En la región visible la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro de longitudes de onda, si interacciona con una molécula puede ser dispersada o absorbida.

Absorción:

Cuando una partícula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe energía y se transforma en una partícula en estado excitado. La molécula absorbe la energía de la onda y aumenta su energía, y ese aumento de energía es igual a la energía de la Radiación Electromagnética absorbida (E = h.n). La partícula en estado excitado tiende a volver de forma espontánea a su estado de reposo desprendiendo la energía absorbida en forma de calor.

“Espectro de Absorción”. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromógeno, tiene un determinado espectro de absorción. El espectro de absorción es un gráfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abscisas la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución es el fundamento de la espectrofotometría de absorción.

Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia).

Emisión:

Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo la emisión de energía radiante. En este caso, lo que se mide es la energía emitida y, en este fenómeno se basa la “fotometría

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