Extraccion Del ADN

Extracción de ADN a partir de tejido vegetal de cítricos: Cuatro métodos de extracción de ADN total previamente reportados, fueron comparados. Tres de ellos se basaron en CTAB y 2-Mercaptoetanol (Thompson, et al., 1983; Murray y Thompson, 1980; y Rodríguez et al., 2010) y uno reportado por la casa comercial Qiagen. Fueron evaluadas diez muestras por cada método. Para ello, el ADN total fue extraído a partir de la nervadura central de cada una de las muestras colectadas, las cuales fueron finamente cortadas y pulverizadas utilizando nitrógeno líquido de acuerdo a estos cuatro protocolos. Todos fueron comparados evaluando para cada uno de ellos cuatro parámetros de calidad que son concentración, pureza, rendimiento e integridad, ya que de éstos puede depender la detección de la enfermedad durante los procedimientos analíticos basados en PCR (García-Cañas et al, 2004), y los contaminantes que proceden del proceso de extracción pueden inhibir estas reacciones (Hughes S. y Moody A, 2007).

Extracción de ADN a partir de psílidos de D. citri: Para la extracción de ADN a partir de psílidos se compararon tres métodos: Manjunath et al., (2008), Aljanabi et al., (1998) y Teixeira et al., (2005). En todos los casos, la muestra empleada estuvo compuesta por seis ninfas o seis adultos. La concentración, pureza e integridad fueron los tres indicadores de calidad evaluados.

En cada uno de los métodos de extracción de ADN a partir de tejido foliar se determinó la concentración (ng ul-1), el rendimiento (ng de ADN mg-1 de tejido vegetal), la pureza, mediante la relación de absorbancia 260/280nm, al indicar presencia o no de contaminantes proteicos, e integridad en relación a la no degradación del ADN total. Una vez fueron evaluados los parámetros de calidad, se observó que el ADN obtenido a partir del protocolo reportado por Murray y Thompson (1980), mostró los parámetros requeridos, así como su concentración y pureza determinada a través del equipo Nanodrop 1000 (Fig. 1). En lo que respecta al protocolo de extracción empleado por Thompson (1983), se estableció que si bien su concentración fue óptima para las necesidades de amplificación (396,8 ng mg-1 de tejido vegetal, en promedio), su pureza (1,2) indicó posiblemente presencia de polifenoles debido a la ausencia de PVP durante la extracción de ADN, y su integridad (2,4) también fue deficiente, ya que se evidencia degradación, que puede disminuir la eficacia del proceso de PCR (Holden M.J. et al 2003).

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