Extraccion De ADN

Introducción

La de extracción del ADN requiere de procedimientos esenciales y a la vez delicados los cuales requieren precisión y concentración además de ser ordenados al momento de ejecutar cada uno de los pasos a desarrollar, este proceso, de extracción de ADN se ocupa básicamente para trazar habilidades aplicadas de la investigación y al diagnostico de abundantes entidades de origen genético, basado esto en un comienzo de que la molécula de ADN es única para cada ser vivo y para obtener una adecuada extracción de este, debemos estimar variados parámetros que conlleven a un adecuado aislamiento en términos cualitativos, cuantitativos y pureza, para esto es imprescindible una correcta segregación del ADN en concordancia a otros componentes celulares para evitar inconvenientes a la hora de análisis posteriores.

Luego, proceder al uso de distintos métodos de laboratorio con el propósito de efectuar análisis variados de material genético, como la valoración electroforetica, el cual es un procedimiento que permite otorgar un medio sensible y rápido para valorar la concentración de ácidos nucleicos donde estas mismas pueden ser cuantificadas, además de analizar la calidad del ADN ya que las muestras degradadas muestran barridos en formas de banda de ácidos nucleicos. Además de esto elaboramos análisis de absorción UV de los nucleótidos con el procedimiento de espectrofotometría para la determinación de la concentración de los ácidos nucleicos en las muestras en donde existen medidas, con las cuales podremos decretar la pureza en la que se encuentran nuestras muestras.

Desarrollo

Procedimiento.

Actividad N°1:

Rotulamos dos tubos de 15 ml con las iniciales de los donantes de la muestra. Agregamos 2 ml de PBS al tubo, tomamos esta solución y con ella hicimos un enjuague, la cual cuidadosamente retornamos al tubo.

Con un esopo los donantes se rasparon las mejillas de la boca e introdujeron esto en el tubo y lo agitaron para liberar las células.

En un tubo eppendorff se colocaron 500 uL de saliva, los cuales fueron centrifugados por 5 minutos a 2000 rpm. De esto obtuvimos el sobrenadante y el pellet, donde se elimino el sobrenadante.

Actividad N°1 y 2, en paralelo:

Ya obtenido el tubo después del centrifugado.

En el tubo N°1 fueron agregados 500 uL de Buffer de Lisis, se mezclo cuidadosamente y se adiciono 50 uL de Proteinasa K. El tubo a continuación fue colocado en un baño termo regulado a 50 °C por 10 minutos.

En el tubo N°2 se agregaron 50 uL de agua libre de nucleasas (para que el DNA no se degrade) y se calentó por 5 minutos a 100 °C.

Pasado el tiempo retiramos los tubos.

Al tubo N°1 le añadimos 50 uL de NaCl, lo homogenizamos y le adicionamos 900 uL de etanol frio.

Al tubo N°2 se le agregaron 50 uL de Acetato de Amonio y 950 uL de etanol frio.

Los tubos luego de esto fueron puestos en una gradilla a – 20 °C por 20 min y terminado el tiempo centrifugados por 15 minutos a 13000 rpm.

Al obtener nuestros tubos les eliminamos el sobrenadante y lo restante fue resuspendido en 50 uL de agua libre de nucleasas.

Actividad N°3: Cuantificar la concentración y la pureza del DNA en equipo nanodrop 2000.

Se realizo un blanco con 1 uL de agua sin nucleasas.

Una vez hecho esto , se procedió a agregar 1 uL de la muestra a cuantificar.

Resultados de las muestras.

El DNA en estado de pureza tiene una fluctuación de 1,7 – 1,9. Nuestras muestras se encuentran respectivamente en el carril 6 y 7.

ADN (ng/uL) A260 A280 260/280 260/230

Tubo N°1 94.3 1.886 1.324 1.42 0.39

Tubo N°2 21.6 0.432 0.345 1.25 0.61

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