Fenotípicas

Artículo

Introducción

El impacto clínico de la resistencia antimicrobiana requiere el estudio de los mecanismos implicados con el fin de contribuir a una adecuación rápida y dirigida del tratamiento así como para el seguimiento y el control epidemiológicos.

En la presente revisión se detallan las pruebas in vitro para la detección e inferencia fenotípica de los mecanismos de resistencia subyacentes más frecuentes en los géneros Staphylococcus, Enterococcusy en Streptococcus pneumoniae frente a las familias de antimicrobianos de uso habitual. En el caso de los estafilococos se describen las pruebas para la detección de resistencia a los betalactámicos, en particular a la oxacilina en sus distintas formas, homogénea, heterogénea y borderline; los mecanismos implicados en la resistencia a MLSB (macrólidos, lincosamidas y estreptograminas B); los que afectan a los aminoglucósidos; al linezolid y a la mupirocina así como los responsables de la sensibilidad disminuida a los glucopéptidos. En los enterococos se abordan la resistencia de alto nivel a los aminoglucósidos (gentamicina y estreptomicina) y la resistencia a los glucopéptidos. Finalmente, en el caso de neumococo, se detalla la resistencia a los betalactámicos y las diferentes PBP implicadas en cada caso con referencia explícita a la interpretación de los distintos niveles de sensibilidad según se trate de aislados meníngeos o no meníngeos. Asimismo, en esta especie se analiza la resistencia a las fluoroquinolonas y el fundamento del desarrollo escalonado de la misma así como las pruebas para la detección del primer o bajo nivel de resistencia a estos compuestos. Los puntos de corte considerados para la interpretación de la sensibilidad son los indicados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2011) si bien en determinados casos se incluyen los correspondientes al European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST, 2011) y alComité de l‘Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (SFM, 2010)1, 2, 3.

Resistencia a los antimicrobianos en estafilococosResistencia a los betalactámicosResistencia a las penicilinas por producción de betalactamasa

El fenotipo de resistencia a la penicilina mediado por betalactamasa(s) en estafilococo implica resistencia a todas las penicilinas excepto a las isoxazolilpenicilinas: oxacilina, meticilina, cloxacilina y nafcilina así como sensibilidad a las combinaciones de betalactámico con inhibidor de betalactamasa (ácido clavulánico, tazobactam y sulbactam), a las cefalosporinas y a las carbapenemas.

Las penicilinasas estafilocócicas son betalactamasas de clase A, por tanto, sensibles a los inhibidores clásicos ya mencionados y de las que se han descrito cuatro tipos: A, B, C y D, si bien la más frecuente es la de tipo C4. Algunas de estas penicilinasas pueden hidrolizar ciertas cefalosporinas en presencia de inóculos elevados (efecto de inóculo). Así por ejemplo, existe un marcado efecto de inóculo sobre la cefalexina si el estafilococo produce las betalactamasas de tipo A o C y un efecto de inóculo moderado sobre la cefalotina si produce las de tipo B o C. En ningún caso existe efecto de inóculo frente a cefuroxima ni frente a ceftriaxona5.

Detección fenotípica de resistencia por producción de betalactamasas

Para la detección de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la penicilina por producción de betalactamasa es más adecuado utilizar un disco de 10 unidades de penicilina que un disco de 10μg de ampicilina. El resultado obtenido con este disco de penicilina se debe extrapolar a todas las penicilinas lábiles a la acción de la penicilinasa, como ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina y piperacilina. Para la determinación de la CMI a las penicilinas se debe utilizar el medio de Mueller-Hinton, cuya concentración de cationes (Ca+2 y Mg+2) debe estar ajustada en el caso de que se realice mediante el método de dilución en caldo; se requiere un inóculo equivalente al 0,5 de la escala de McFarland y entre 18-20 horas de incubación a 35-37°C. Cuando el halo de inhibición con el disco de penicilina de 10 unidades sea de≥29mm (sensible) o por dilución en caldo o en agar, la CMI de penicilina sea de≤0,12mg/L (sensible) se debe confirmar que el microorganismo es realmente sensible a las penicilinas; para ello, se realiza una prueba con la cefalosporina cromogénica nitrocefin utilizando las colonias crecidas en el borde del halo de inhibición de la penicilina ya que en estas, la producción de penicilinasa ha sido inducida por la incubación previa en presencia del antimicrobiano. Esta prueba consiste en depositar con el asa parte de esas colonias sobre un disco impregnado con el nitrocefin que al hidrolizarse en presencia de la betalactamasa experimenta un cambio en su estructura dando un producto coloreado (naranja-rojo)6.

Resistencia a la meticilina: homogénea y heterogénea

La resistencia a la meticilina, más frecuente entre las diferentes especies de estafilococos coagulasa negativa (ECN, con la excepción de Staphylococcus lugdunensis y Staphylococcus saprophyticus) que en S. aureus, se debe a la adquisición del gen mecA que codifica la proteína fijadora de penicilina (PBP) PBP2a, supernumeraria, que posee baja afinidad por todos los betalactámicos y por tanto implica resistencia a todos estos compuestos con la excepción, hasta el presente, de la cefalosporina ceftarolina y de la carbapenema razupenem, ninguna de las cuales ha sido aún introducida para uso clínico7, 8.

En España, la prevalencia de resistencia a la meticilina en S. aureus (SARM) se mantiene en torno al 30%, mientras que entre las diferentes especies de ECN (ECNRM) las cifras oscilan entre el 60-70%9.

S. aureus posee cuatro PBP de las cuales la 1, 2 y 3 son esenciales. La PBP de baja afinidad denominada PBP2a o PBP2′, de 78kDa, está codificada por el gen cromosómico mecA. La expresión de la resistencia mediada por este gen es compleja y se afecta por diferentes factores como la temperatura, el pH, la osmolaridad así como por la presencia de secuencias cromosómicas reguladoras y de otros genes cromosómicos no relacionados. Esta expresión, tanto en SARM como ECNRM, puede ser homogénea o heterogénea. En las cepas que presentan resistencia homogénea o de alto nivel a la oxacilina, la mayor parte de la población expresa dicha resistencia. Las cepas con expresión heterogénea (CMI de oxacilina 1-16mg/L) se caracterizan porque solo una pequeña proporción de la población (≤0,1%) sobrevive a concentraciones de oxacilina superiores a 10mg/L, mientras que la mayor parte no es viable a bajas concentraciones del antimicrobiano (1-5mg/L). La mayoría de los aislamientos clínicos presentan este patrón de heterorresistencia bajo las condiciones rutinarias de cultivo. Sin embargo, las cepas heterogéneas pueden aparecer como homogéneas bajo ciertas condiciones, como el crecimiento en un medio hipertónico (con 2% de NaCl) o con una incubación a 30°C. Estos cambios en la expresión de la resistencia bajo diferentes condiciones de cultivo son transitorios y solo de expresión fenotípica6, 10.

Detección fenotípica de resistencia a la oxacilina

La resistencia a la meticilina en Staphylococcus se puede detectar en el laboratorio mediante la técnica de difusión con discos de oxacilina (1μg) y/o cefoxitina (30μg) o por dilución en caldo o en agar. Para ello se utiliza el medio de Mueller Hinton con el agregado de 2% de NaCl en el caso de realizar los métodos de dilución y además ajustado con cationes (Ca+2 y Mg+2) en el caso de que se realice mediante el método de dilución en caldo. El inóculo empleado es el equivalente al 0,5 de la escala de McFarland y se requieren 24 horas completas de incubación en atmósfera aerobia a 35°C. La incubación a temperaturas superiores a 35°C puede impedir la detección de esta resistencia. Una cepa de S. aureus se considera resistente a la oxacilina cuando el halo de inhibición de la oxacilina es≤10mm o cuando la CMI de oxacilina es≥4mg/L. En el caso de los ECN, una cepa se considera resistente a la oxacilina cuando la CMI es≥0,5mg/L, excepto en S. lugdunensis que se considera resistente si la CMI de oxacilina es≥4mg/L10, 6.

La cefoxitina es un marcador adecuado de la presencia de mecA ya que es un compuesto inductor más potente del sistema regulatorio de mecA que las penicilinas y por ello, al mejorar la expresión de este gen se mejora también la detección de la resistencia a la meticilina. La utilización del disco de cefoxitina es especialmente útil y de preferencia sobre el disco de oxacilina para detectar la resistencia a oxacilina mediada por el gen mecA en las cepas heterorresistentes y se debe utilizar siempre en cepas de ECN. Además, este disco no presenta problemas de estabilidad como la oxacilina durante su conservación.

Las cepas con heterorresistencia suelen aparecer como sensibles a muchos betalactámicos cuando se realiza un antibiograma con discos y su interpretación como tal puede conducir a fracasos terapéuticos. Por tanto, las cepas de estafilococos resistentes a la cefoxitina (halo de ≤21mm en S. aureus, CMI de ≥8mg/L y de ≤24mm en ECN, CMI no definida) indican la presencia de mecA y en consecuencia, la resistencia a todos los betalactámicos. Por el contrario, la sensibilidad a cefoxitina enS. aureus (halo de≥22mm, CMI de ≤4mg/L) o en ECN (halo≥25mm, CMI no definida) descarta la presencia del gen mecA y por tanto la heterorresistencia a la meticilina1, 10, 11.

Resistencia borderline (límite) a la oxacilina (BORSA) en Staphylococcus aureus

Existen cepas de S. aureus que presentan resistencia de bajo nivel o borderline (en el límite) a la oxacilina

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