Inducción-Represión Operon Ara

Práctica 1: Inducción-Represión del operón Ara

Resultados

En esta práctica se demostró el efecto de la represión por catabolito en la expresión del operón Ara. Se preparó una serie de 12 tubos con medio de cultivo con diferentes concentraciones de inductor (arabinosa5%) y represor (glucosa5%), así como de Ampicilina (10mg/ml) y la misma concentración de inóculo para todos los tubos. El inóculo utilizado E.coli-pGLOTM (kit166-0003EDU/Bio-Rad) proviene de la cepa de E.coli BL-21.

A los tubos 1 y 3 no se les adicionó ampicilina mientras que a los tubos 2 y 4 se le agregó 25µl a cada uno. Después se añadió 125µl de arabinosa a 5% a los tubos 3 y 4.Por último se puso en los tubos 1,2,3 y4, 25µl de inóculo en cada uno. No se agregó glucosa a ninguno de los 4 tubos.

Los tubos dejaron incubando a 37°C/150rpm toda la noche y se almacenaron en refrigeración. Posteriormente se observó el paquete celular bajo una lámpara de luz UV en banda A (365-465). Los resultados fueron los siguientes:

# de tubo Concentración requerida

Stock 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ampicilina 10mg/ml 0 100 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Arabinosa5% 0 0 0.25 0.25 0.12 0.05 0.03 0.25 0.25 0.25 0.25 0

Glucosa5% 0 0 0 0 0 0 0 0.25 0.12 0.06 0.03 0.25

E. coli-pGLO 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Fluorescencia - + ++ + +++ +++ ++ - - - + -

Discusión

El plásmido recombinante pGLO lleva consigo el gen gfp proveniente de la medusa Aequoria victoria el cual codifica para la proteína verde fluorescente (Shimomura, 1998), es por eso que al poner los tubos bajo la lámpara de luz UV algunos presentaban fluorescencia. En el plásmido pGLO, la secuencia promotora que controla la expresión del gen gfp usualmente regula la transcripción de un grupo de genes en E.coli llamado el operón Ara. La proteína activadora de este operón es AraC. AraC solo se une a la secuencia activadora apropiada en presencia de la azúcar arabinosa (Snyder and Champness, 1997)

Cada tubo presentaba diferente intensidad de fluorescencia, esto se debe a la diferente concentración de glucosa y arabinosa que fue agregada al medio. En el tubo 10 (Tabla 1) se pudo apreciar que aunque había una concentración mayor de arabinosa que de glucosa, no se presento fluorescencia. Hay que tomar en cuenta la cantidad de moléculas de glucosa presentes a esa concentración que es igual a 5.01x1021 moléculas. El inóculo usado contaba con aproximadamente 1x106 células de E.coli por mililitro, esto quiere decir que en 25µl hay aproximadamente 25000 células y considerando que cada célula consume 200 moléculas de glucosa por segundo, 5.01x1021 es una gran cantidad de moléculas para poder usar como fuente principal de carbono e inhibir la transcripción del operón Ara. Altos niveles de glucosa inhiben la síntesis de AMP cilcico (AMPc), y sin el AMPc, la proteína activadora de catabolito (CAP) no se puede unir a la secuencia blanco. Sin el complejo cAMP-CAP, la RNA polimerasa no se une eficientemente al promotor (PBAD) incluso en presencia del complejo arabinosa-AraC(Proteína activadora) y en consecuencia, ocurre muy poca transcripción (Mosher,2002) y es por eso que no se vio luminiscencia en el tubo.

A los tubos 1 y 2 no se les adicionó glucosa ni arabinosa, sin embrago se observó muy poca fluorescencia en el segundo (Fig.1). Una causa de que el resultado fuerá positivo en el tubo número 2, es que el inóculo que se usó en la práctica fue incubado en presencia de arabinosa. Las condiciones del medio del inóculo favorecieron la expresión basal del operón Ara. Cabe destacar que en el tubo 1 no contenía ampicilina y no se presentó fluorescencia. El plásmido pGLO además de contar con el gen gfp lleva

...