Informe Corte de ADN

Corte de ADN con enzimas de restricción

1. Introducción

Hace más de tres décadas fueron descubiertas las enzimas de restricción, la ADN ligasa y vectores plasmídicos como el pBR322, los cuales iniciaron la era de la ingeniería genética (Nathans y Smith, 1975; Bolívar et al., 1977)

La tecnología del ADN recombinante comprende una serie de métodos para identificar un gen (o segmentos concretos de ADN) en un organismo, aislarlo, analizarlo, si es preciso, modificarlo y reinsertarlo dentro de otro organismo consiguiendo que se exprese con normalidad. Estas técnicas han permitido un avance considerable de la biología y genética molecular, la medicina, la agricultura y la ecología (Garrido 2006)

El corte del genoma para obtener fragmentos de ADN se realiza mediante enzimas de restricción o endonucleasas de restricción. Estas sustancias reconocen secuencias específicas de ADN de doble cadena y cortan ambas en lugares específicos. Las secuencias reconocidas son palindrómicas, esto es, poseen simetría rotacional respecto a un eje. Los cortes son de dos tipos: uno en que se cortan las cadenas simétricamente respecto a un eje y otro en que se cortan en el mismo punto. El primero deja extremos cohesivos o adhesivos y el segundo deja extremos romos (Isidoro, 2019)

Se han caracterizado y purificado cientos de enzimas a la que se denomina por una abreviatura correspondiente a la especie bacteriana de la que derivan. Así, Bam de Bacillus amgloliquefaciens, Eco de Escherichia coli, Hal del Haemophilus aegyptius, etc. Dependiendo del tamaño, los fragmentos de ADN obtenidos pueden separarse mediante electroforesis en poliacrilamida o agarosa. Los geles de poliacrilamida separan fragmentos de aproximadamente 1.000 pares de bases y los geles de agarosa de 15.000-20.000 pares de bases. Los fragmentos se separan en una banda que se puede visualizar agregando pigmentos como el bromuro de etidio a las soluciones de gel que emiten una fuerte fluorescencia naranja bajo la luz ultravioleta. La longitud o el tamaño de un fragmento de ADN se pueden determinar comparando la banda con fragmentos estándar (marcadores) de longitud conocida. Cada fragmento de ADN se puede purificar extrayendo la banda adecuada del gel y eliminando la matriz del gel y el tinte (Isidoro, 2019; Rocha-Salavarrieta, 2002)

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

1. Tubos eppendorf de 1.5 ml

2. Micropipetas de 1-20, 10-100 y 100-1000 μl de volumen

3. Puntas para micropipetas

4. Muestra de ADN a cortar

5. Buffer de corte para la enzima

6. Enzima de restricción

7. Agua destilada estéril

8. Baño María o estufa

2.2. Metodología

Para efectuar el corte del ADN primero se calcula la cantidad de enzima necesaria para cortar 1µg de ADN en 1 hora a una temperatura de 37ºC (Unidad enzimática). Luego de ello en un tubo eppendorf mezclamos 250ng de ADN, 2 µL de buffer de reacción, 1 U de EcoRI y agua destilada estéril hasta completar 20 µL y agitamos levemente.

Mantenemos en incubación a 37ºC por 1 hora y preparamos el gel de electroforesis; para ello primero pesaremos en una tara 0,40 g de agarosa y en un erlenmeyer colocaremos 40 ml de buffer TBE junto con la agarosa, llevamos a calentar el erlenmeyer hasta que la agarosa quede completamente fundida, esperamos unos minutos y colocamos 3µL de tinte y envasamos en el molde del gel.

Luego de ello mezclamos 1µL de bluejuss con 4 µL de ADN de todas las muestras, para el testigo se mezcla 3 µL de ADN y 1 µL de bluejuss (este ADN no fue cortado y

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