La expresión génica - ADN y ARN

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la expresión génica se regula a menudo durante La elongación de la cadena de ARN. Reglamento depende tanto de interrupciones a la transcripción causada por la pausa, detención, y señales de terminación codificados en el ADN y el ARN y las proteínas auxiliares que modifican la respuesta de la RNA polimerasa (RNAP) a estas señales (revisado en refs. 1 y 2). Haciendo una pausa (un retraso temporal en la elongación de la cadena) sincroniza la transcripción y la traducción en procariotas, ralentiza RNAP para permitir la interacción oportuna de factores de regulación, y es un precursor de ambos arresto (detención completa sin disociación; referencias 3 y 4.), Y la disociación de la complejo elongación de la transcripción (TEC) en r-dependiente-independente terminador (1). Numerosas proteínas auxiliares modulan deteniéndose en los organismos desde las bacterias hasta los seres humanos. Dos de ellos, NusA y NusG, son universalmente conservadas entre las bacterias y arqueobacterias (5), son por lo general esencial para la viabilidad celular, y, respectivamente, inhibir o  estimular deteniéndose por RNAP bacterianas (6). NusA y NusG también modulan la actividad de terminación de rProteína (whichdissociates detuvieron TEC) y, junto con otras proteínas auxiliares como l N o Q, se reúnen TEC antitermination que resisten deteniéndose y terminación. Aunque pausa transcripcional fue descrito por primera vez hace más de dos décadas (7), no existe ninguna secuencia de pausa consenso. Más bien, diferentes tipos de señales parecen inhibir la alineación de la ARN 39 OH con NTP sustrato de diferentes maneras (8-12). . Mayoría si no todas estas señales dependerá de la capacidad de RNAP a deslizarse hacia atrás y hacia adelante a lo largo de las cadenas de ARN y ADN (conservando un '17 burbuja ADN -nt y 'híbrido RNAzDNA 8 pb; referencias 4, 13, 14, y las referencias en él ). Estos movimientos pueden producir cinco TEC configuraciones distintas (ver Fig. 1): (i) dio marcha atrás (ARN desplazados sobresale corriente abajo del sitio activo); (ii) desgastado (39 RNA separado nt de ADN); (iii) pretranslocated (39 nt ARN bloqueando la NTP vinculante o subsitio i11); (vi) activa (39 nt ARN en el cebado o i subsitio; sitio de unión a NTP

abiertos u ocupados por NTP); y (v) hypertranslocated (ARN 39 nt se alejó del centro catalítico). Durante la elongación rápida, RNAP fluctúa entre los estados pretranslocated y activos. Para aclarar el mecanismo de hacer una pausa y examinar la forma en que está modulada por NusA y NusG, se compararon los dos tipos de señales de pausa que se han estudiado más ampliamente, lo que nosotros llamamos pausas  clase I y de clase II .

La pausa de clase I interacción horquilla RNAP ARN naciente inhibe además nucleótido mediante la estabilización de la ARN 39 OH en posición  hypertranslocated (15, 16). En una pausa de la clase II, un débil híbrido RNAzDNA induce retroceso de RNAP a uno o más estados que ocluyen el sitio activo con ARN naciente (9-11). La mayoría de las señales de  pausas de clase I se han encontrado en las regiones líderes de ciertos operones de biosíntesis de aminoácidos de enterobacterias, donde se sincronizan RNAP y el movimiento del ribosoma durante la atenuación (17). Estudios anteriores establecen que las señales de  clase I de pausa son multipartito. Analisis extenso del sitio de pausa  revela que esta pausa es dependiente larga en gran medida de la horquilla de ARN, pero también se ve afectada por la región 11-nt entre la horquilla de pausa y el extremo 39, la nt en el sitio activo, y el primer 14 pb de ADN rio abajo (15). Anteriormente, pausas de clase II se han caracterizado sólo en vitro o en arresto en los sitios de terminación , donde un híbrido RNA-DNA es menos estable induce retroceso de RNAP (3, 4, 18). Retroceso puede  retirarse RNAP por 10 nt o más, pero se ha observado directamente sólo cuando RNAP se detiene artificialmente por la privación de NTP en una pausa horquilla menos o sitio de detención (4, 10, 14, 19, y las referencias en él). Ellos presesentan la identificación y caracterización  fisiológicamente relevantes de una pausa de  clase II. ops (operón polaridad; supresor. ref 20) sitios de pausa se ​​producen en la región a principios transcrito de Escherichia coli operones que codifican o afectan la síntesis de macromoléculas extracytoplasmic como hemolisina. Su función es permitir la contratación de RfaH, una proteína auxiliar que suprime la terminación prematura de la transcripción (20). Se demuestra que el suyo (clase I) y ops (clase II) las señales, si bien comparte algunas características, son mecánicamente distinta, que difieren en la configuración de una pausa de RNAP sitio activo y en sus respuestas a las proteínas de elongación NusA y NusG.

Materiales y métodos

Fuentes de oligonucleótidos y proteínas.

Todos los oligonucleótidos fueron obtenido de Operon Technologies (Alameda, CA). De tipo salvaje y marcada con His RNAP (16), NusA (21), y GreA (22) fueron purificado como se describió anteriormente. Cromosómico NusG se clonó entre NdeI y HindIII sitios de pET28a (Novagen); la el plásmido resultante, pIA247, codifica 20 aminoácidos adicionales (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH) al no conservado N-terminal Cuando inducido en cepa BL21, NusG era soluble y constituido '20% de la proteína celular total. Las células se lisaron por sonicación en tampón NTA (50 mM Tris HCl (pH 7,9) mM Y300 NaCl 0,1 mM EDTA 0,1 mM PMSF 1 mM b-mercaptoetanol). Lisado aclarado se cargó en un gel de agarosa Ni-NTA (Qiagen, Chatsworth, CA) de la columna. Después de cuatro lavados consecutivos con 10 vol de tampón NTA que contiene 0, 1, 10, y 30 mM de imidazol (pH 7,9), NusG se eluyó con imidazol 150 mM y se dializó. frente a tampón de almacenamiento (Tris HCl 10 mM (pH 7,9) Y0.1 M MM EDTA NaCl 50% Y0.1 glicerol TDT 0,1 mM). Su-etiquetados NusG era 0,90% puro y se comportó de manera similar a la de tipo salvaje NusG (regalo de M. Gottesman, la Universidad de Columbia, Nueva York) en en ensayos de transcripción in vitro.[pic 4]

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ops Sitios. La señal ops de consenso de 12 nt es GGCGGTAGnnTG [identificado por análisis de secuencias transcritas en operones que están regulado por RfaH (20)]. Usando esta secuencia de consenso, 17 ops sitios, de los cuales 15 fueron seguidos de cerca por un ORF, se identificaron en la secuencia del genoma de E. coli (23) en las posiciones 232 196 (sin ORF), 504.357 (sin ORF), 598.983 (PHEP), 605.824 (yi81_2), 1.035.383 (hyaF), 1619170 (ydeD), 1.812.043 (b1730), 1.880.364 (B1801), 2.111.170 (rfbB), 2135455 (b2062), 3.040.562 (b2899), 3.325.384 (yhbY), .435.371 (SMF), 3495017 (cysG), 3.805.820 (rfaQ), 4.146.046 (Yijo), y 4.214.647 (yjaB). Varios sitios más ops se encuentran en plásmidos F y No las islas de patogenicidad en la secuencia del genoma de E. coli publicada (24, 25). Oligos sintéticos que codifican las señales ops PHEP o rfaQ eran clonó entre los sitios BglII y SpeI de pCL102b (15), en sustitución de la región subrayada del su secuencia transcrita (muestra de 11) ATCGAGAGGGACACGGGGAAACACCACCATCATC- ACCATCATCCTGACTAGTCTTTCAGGCGATGTGTGC- TgGAAGACATTCAGAT con GGCGGTAGCGTgCTT- TTTTC (rfaQ) o GGCGGTAGTCTGTgCGCTGT (PHEP) secuencias (los principales sitios de pausa se ​​producen justo antes de g minúscula). Ambos sitios confieren respuesta a RfaH in vitro (datos no mostrados).

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