PCR Biología moleculares

TFUNDAMENTO TEÓRICO

La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (“Polymerase Chain Reaction”, PCR), permite la amplificación en el número de copias de una secuencia de DNA in vitro. Esta técnica posee gran sensibilidad, ya que puede detectar y amplificar pequeñas cantidades de DNA en casi cualquier tipo de muestra.

El inventor de ésta técnica fue Kary Mullis en 1983 por la cual obtuvo el Premio Nobel de química en 1993, utilizándola para el diagnóstico prenatal de la anemia falciforme amplificando el gen de la -globina humana.

Desde la invención de la técnica se han revolucionado todos los campos que estudian y manipulan los ácidos nucleicos. Entre algunas de las innumerables aplicaciones desarrolladas destacan el diagnóstico de enfermedades genéricas prenatales, la detección de secuencias de ácidos nucleicos de organismos patógenos en muestras clínicas (por ejemplo, sangre o semen), análisis de mutaciones de oncogenes activos, la caracterización de muestras forenses para la identificación de sospechosos ó de los padres en los litigios de paternidad. Además el análisis de secuencias de DNA mitocondrial humano y sus resultados se utilizan para formular modelos de la evolución humana. Adicionalmente el campo de la “antropología molecular” también se ha desarrollado a partir del conocimiento de ésta técnica.

En el proceso de amplificación por PCR, la enzima DNA polimerasa cataliza una serie de reacciones de síntesis de ADN en donde se utilizan los oligonucleótidos como iniciadores (también llamados primers o cebadores), los cuales flanquean la región a amplificar. Se tiene que contar con dos oligonucleótidos (uno directo y uno reverso), en donde cada uno de ellos sea complementario a la cadena de DNA a amplificar y que tenga disponible su extremo C3’ ya que éste sitio será utilizado por la DNA polimerasa para iniciar con la polimerización de la nueva cadena. En un primer ciclo de amplificación, el DNA que contiene las secuencias a amplificar se desnaturaliza (subiendo la temperatura a 94°C) y posteriormente se baja la temperatura entre 50 y 60°C para que ocurra el alineamiento de los oligonucleótidos con su DNA complementario.

A continuación, se sube la temperatura a 72°C para que se realice la extensión de las nuevas cadenas a sintetizar por acción de la DNA polimerasa, a partir de los extremos 3’ de los oligonucleótidos empleados. Los pasos descritos se repiten entre 30 y 40 veces para obtener millones de copias del DNA, delimitado por los oligonucleótidos que flanquean a la región de interés.

El equipo de laboratorio diseñado para realizar las variaciones de temperatura es el termociclador. Al final del primer ciclo se obtienen dos fragmentos nuevos de DNA, después del segundo ciclo se tienen 4, después del tercer ciclo 8, de tal manera

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