PCR GENETICA

La PCR aprovecha los mecanismos de replicación natural del ADN y tiene como resultado la producción in vitro de grandes cantidades de una secuencia deseada de ADN a partir de una mezcla compleja de secuencias heterogéneas (134). La PCR puede amplificar una región seleccionada de 50 a varios miles de pares de bases en billones de copias. Mullis et al. (93) describen una discusión detallada sobre la metodología y las aplicaciones de la PCR.

La amplificación del ADN mediante la PCR consiste en una sucesión cíclica de etapas de incubación a diferentes temperaturas. Primero el ADN diana se desnaturaliza por calor para separar las dos cadenas complementarias para conseguir moldes monocatenarios. Posteriormente los cebadores específicos (moléculas sintéticas cortas de ADN complementario para ambas cadenas y que flanquean las secuencias diana) se asocian (hibridan) con los moldes monocatenarios a baja temperatura y se extienden con ADN polimerasa a una temperatura intermedia. Una vez que la polimerasa ha sintetizado una nueva cadena de ADN, se separa el producto del molde calentando a una temperatura mayor. Estas etapas, referidas como ciclos, se repiten 20–40 veces, lo que conlleva la amplificación de las secuencias del ADN diana. La clave para la amplificación geométrica de las secuencias del ADN diana mediante la PCR es la selección de los pares de cebadores que, cuando se extienden, crean lugares de hibridación de los cebadores recíprocos adicionales para la extensión de los cebadores en los ciclos posteriores. Para detectar el ARN (p.ej. virus de ARN), primero se debe hacer una copia de ADNc del ARN utilizando la transcriptasa inversa (RT). Entonces el ADNc actúa como molde para la amplificación mediante la PCR. A esta técnica se la denomina RT-PCR.

...