PRECIPITACIÓN DE PROTEINAS

INGENIERIA BIOQUIMICA I

Cursada 2005

OBTENCIÓN DE PGASA (Parte 2)

PRECIPITACIÓN DE PROTEINAS

Objetivo del trabajo práctico: Concentrar y purificar proteínas provenientes del cultivo de A. kawachii en medio líquido (fuente de carbono: glucosa)

Introducción:

La precipitación consiste en la conversión de proteínas solubles a estado insoluble. La alteración de la solubilidad de una proteína puede lograrse modificando el pH, la fuerza iónica de la suspensión, modificando o agregando disolventes o modificando la temperatura. (Ver guía anexa, bibliografía y archivo .ppt de purificación de proteínas)

En el practico se precipitarán las proteínas por el agregado de solvente orgánico (acetona)

TRABAJO EXPERIMENTAL

Precipitación con acetona

Se toman 170 ml de cultivo (previamente concentrado por rotavapor ) y se le agregan 400 ml de acetona (1 volumen cultivo +2,5 volúmenes de solvente orgánico)

Procedimiento:

1. Se preenfría la acetona a -20C.

2. Se enfría el cultivo en baño hielo-agua (0C)

3. Se agrega gota a gota el volumen de acetona correspondiente, con agitación lenta.

4. La acetona se mantiene a baja temperatura en baño hielo-agua.

5. La mezcla no debe superar los 2C. Se continúa la agitación de la mezcla durante 2 horas sin interrumpir la agitación, en baño hielo-agua.

6. Se centrifuga en frío 10000 g durante 10 minutos.

7. Se resuspende el precipitado con 20 ml buffer acetato de sodio 20 mM pH 5.

Figura 1: Centrifugación luego de la precipitación

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