PRÁCTICA No.1 MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

PRÁCTICA No.1

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

INTRODUCCIÓN

En microbiología la esterilización es un proceso de destrucción y remoción de toda forma de vida, por lo tanto, un objeto estéril está libre de organismos viables, se dice que un microorganismo está vivo o viable cuando es capaz de reproducirse. El termino estéril genéricamente que significa la eliminación de todas las formas vivientes incluyendo bacterias, virus, esporas y hongos entre otras.

A continuación, se presentan tres de los métodos de esterilización más utilizados en los laboratorios de microbiología.

OBJETIVO GENERAL

Conocer y aplicar los procesos de esterilización más utilizados en el laboratorio de microbiología.

1. ESTERILIZACIÓN POR MEDIO DE CALOR HÚMEDO

FUNDAMENTO

El calor en forma de vapor saturado, a presión es el agente más práctico y eficaz de esterilización. La esterilización en autoclave se basa en la utilización de vapor saturado a presión (calor húmedo) para la eliminación de microorganismos, debido a las altas temperaturas a las que son llevados. La autoclave consta de una cámara de pared que se llena de vapor saturado libre de aire y se mantiene a la temperatura indicada y a la presión establecida, durante un periodo de tiempo determinado. Al utilizar la autoclave es necesario que la cámara se llene de vapor saturado reemplazando el aire.

Este método es utilizado para la esterilización de laboratorio y la gran mayoría de los medios de cultivo. La autoclave es un equipo esencial para cualquier laboratorio de microbiología.

PROCEDIMIENTOS

1. Lavar el material que se va a esterilizar (pipetas, matraces, cajas Petri de vidrio, etc.)
2. Posteriormente envolver con papel estraza las cajas Petri de vidrio y las pipetas tratando que no quede ninguna entrada de aire (en el caso de las pipetas marcar por el lado donde este la boca y colocar una etiqueta que indique el volumen de la pipeta, así como la fecha y hora de esterilización).
3. A los matraces Erlenmeyer (con medio de cultivo previamente preparado) se les hace un tapón de algodón recubierto con pañalina ajustado de tal manera que sea fácil quitarlo y ponerlo. Colocar sobre el matraz Erlenmeyer con tapón de algodón, un capuchón de papel estraza para reducir la posibilidad de una contaminación a la hora de sacarlos del esterilizador. Etiquetar todos los matraces con el nombre del medio de cultivo o sustancia que contenga.
4. Los tubos de ensayo con tapón de rosca, se les debe de aflojar la tapa para evitar que el tapón sea proyectado debido a la presión durante la esterilización. En el caso de los tubos de ensayo sin tapa de rosca, elaborar un tapón de algodón y un capuchón de papel de estraza de la misma manera que se hace para los matraces. Etiquetar todos los tubos con el nombre del medio de cultivo o sustancia que contenga.
5. Se procede a la esterilización en la autoclave asegurándose primero de que el nivel del agua este correcto. Introducir el material (de manera que contengan la mayor cantidad posible) y cerrar bien la tapa, apretando perfectamente los seguros.
6. Una vez cerrado se enciende la autoclave y se espera a que empiece a salir una columna constante de vapor, lo cual nos indica que la cámara se saturo de vapor de agua y se procede a cerrar la válvula.
7. Se espera, a que el manómetro marque 15 lb/pulg2 o 121oC, entonces se mantiene a esa temperatura durante 15 minutos. (la esterilización puede efectuarse a temperaturas y tiempos variables, dependiendo de la naturaleza de lo que se esté esterilizando).
8. Transcurrido el tiempo de esterilización deseado se apaga la autoclave. Una vez que el manómetro marque 4 lb/pulg2, se abre poco a poco la válvula para que se escape el valor disminuyendo así la presión.
9. Cuando el manómetro llegue a cero lb/pulg2 y ya no salga vapor por la válvula, abrir la autoclave y sacar el material estéril con cuidado para su posterior uso.

1.2 ESTERILIZACIÓN POR MEDIO DE CALOR SECO

FUNDAMENTOS

La esterilización por calor seco necesita recurrir a mayores temperaturas que la utilizada para calor húmedo. La esterilización mediante aire caliente en el llamado horno de Pasteur se logra por conducción de calor desde la superficie externa del horno hacia las capas internas donde se encuentra el material a esterilizar. El calor seco mata a los microorganismos desnaturalizando sus proteínas constitutivas. La esterilización por calor seco es un método utilizado principalmente para esterilizar materiales inertes de vidrio y metal resistente al calor.

El método a continuación se describe, se encuentra acorde a la temperatura y tiempo especificado en la NOM-111-SSA1-1994 “Método para la Cuenta de Mohos y Levaduras en Alimentos”.

PROCEDIMIENTOS

1. Limpiar perfectamente el material a esterilizar (pipetas, cajas Petri, tubos de ensayo y matraces).
2. Envolver los materiales de la misma manera que como se describe en el método 1.1 “esterilización por Medio de Calor Húmedo”.
3. Colocar el material envuelto en un horno Pasteur; encender el horno y esterilizar el material a una temperatura de 170°C durante 2 h.
4. Transcurrido este tiempo, dejar enfriar el material estéril y sacarlo del horno, para su posterior utilización.

1. ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN DE MEMBRANAS

        FUNDAMENTOS        

Las células pueden retirarse de los líquidos y gases por filtración, por lo que la filtración es el método de elección para eliminar los microorganismos (a excepción de los virus) de medios de cultivo que contienen compuestos que se alteran fácilmente por el calor (termolábiles). Los filtros de membrana utilizados para este método constan de unas mallas cerradas de fibra de nitrocelulosa que desee retener en la membrana. Los equipos de filtración constan principalmente de un embudo con porta filtros, una bomba de vacío manual con manómetro, un frasco de succión y membranas de nitrocelulosa con pros de 0.45 µm de diámetro. El procedimiento que se presenta a continuación es acorde a algunas especificaciones de la compañía donde proviene el equipo de filtración, así como de especificaciones marcadas por la NOM-181-SSA1-1998 “Requisitos Sanitarios que Deben Cumplir las Sustancias Germicidas para Tratamiento de Agua de Tipo Domestico”. Determinación de bacterias coliformes totales y coliformes fecales. Método de filtración en membrana. Cabe remarcar que en el siguiente procedimiento solo se abarcan al uso de la filtración en membrana para la esterilización de medios de cultivos y compuestos que son termolábiles. El uso de la filtración por membranas para determinación del contenido microbiano se describirá en la práctica No.5 “Métodos para Estimar el Contenido Microbiano”.

PROCEDIMIENTO

1. Prepara el equipo de filtración.
2. Descontaminar el equipo de filtración, ya sea por medio de luz ultravioleta (UV) El rango de radiación UV debe ser de 250 a 260 nm. Se recomienda protegerse los ojos, pueden usarse lentes de seguridad o de vidrio prescritos para la adecuada protección contra la luz UV de la columna de esterilización, que no se aísle durante el tiempo de exposición. Limpie él tubo de UV regularmente y cheque periódicamente su efectividad para asegurar que haya un 99,99% de muerte bacteriana en 2 minutos de exposición. También puede ser posible esterilizar el equipo de filtración en la autoclave a 121°C durante 15 minutos, de acuerdo con las características del equipo de filtración utilizado.
3. Colocar el equipo de filtración en un ambiente estéril (mecheros encendidos).
4. Desprender el embudo y flamear la base del portafiltros (receptáculo).
5. Flamear el embudo de filtración y posteriormente su interior.
6. Utilizando pinzas estériles, colocar una membrana estéril con poros de 0.45 µm de diámetro (con el cuadriculado hacia arriba) sobre el portafiltros poroso.
7. Una vez colocado la membrana sobre el portafiltros del embudo desechar la hoja protectora.
8. Cuidadosamente coloque el embudo sobre el receptáculo y asegúrelo en su lugar.
9. Verter el medio de cultivo o solución termolábil a filtrar sobre el embudo de filtración, mientras se crea un vacío parcial bajo con la ayuda de una bomba de vacío (20-27 pulgadas Hg) conectada a una conexión tipo niple.
10. Una vez que el proceso de filtración haya concluido, quitar el embudo e inmediatamente después y retirar la membrana con pinzas estériles y recoger el filtrado estéril para su utilización. Encontrándose los microorganismos adheridos a la superficie de la membrana.
11. Utilizas unidades de filtración estériles al principio de cada serie de filtraciones, como precaución mínima para prevenir contaminación accidental. Una serie de filtraciones se considera cuando hay un intervalo de interrupción de 30 minutos o más entre cada filtración de muestras. Después de tales interrupciones, trata cualquier muestra como una serie de filtración y esterilizar toda la unidad de filtración en uso. Descontaminar este equipo entre filtraciones sucesivas, de la manera descrita en el punto 1.

PRÁCTICA No.2

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

FUNDAMENTO

Cualquier sustancia que pueda ser usada para el cultivo de microorganismos, puede ser llamada medio de cultivo, el cual es un sustrato o solución de nutrientes en el cual se cultivan y se desarrollan los microorganismos. Estos para su crecimiento y desarrollo necesitan distintos nutrientes, por lo cual se emplean ciertos medios de cultivo con finalidades específicas. En el laboratorio se utilizan determinadas substancias para inducir a las bacterias a reproducirse, de modo que el microbiólogo podrá trabajar con masas visibles de las mismas, y no con células individuales invisibles. Cabe mencionar que ningún conjunto de condiciones llenará los requerimientos de todos los microorganismos.

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