Purificacion De La Lisozima

Objetivos generales

• Purificar la enzima lisozima obtenida a partir de clara de huevo.

• Evaluar la pureza y rendimiento alcanzados.

• Estudiar la dependencia de la actividad y estabilidad de la lisozima en función del pH.

Resultados:

I) Purificación de la lisozima:

I-a) SDS-PAGE

Se realiza una electroforesis en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS en un gel de Poliacrilamida.

Con el objeto de analizar la eficacia del procedimiento para la purificación de la lisozima, se lleva a cabo la corrida electroforética. En cada calle se siembran 10µL de cada fracción obtenida con anterioridad, y en la última calle se siembran 5 µL de marcador de peso molecular.

Gel 1: Calles

1: 10 μl EC1

2: 10 μl FT1

3: 10 μl L11

4: 10 μl L21

5: 10 μl E1

6: 10 μl FT2

7: 10 μl L12

8: 10 μl L22

9: 10 μl E2

10: 5 μl MPM

Las referencias que presentan un subíndice 2, corresponden a las fracciones logradas por el grupo de trabajo.

EC: Extracto Crudo; FT: Flow Throught; L1: 1er Lavado; L2: 2do Lavado; E: Elución; MPM: Marcador de Peso Molecular.

Observaciones:

• La corrida parece no haberse completado, probablemente debido a una interrupción de la fuente de tensión, o a un gel de separación demasiado concentrado. Este inconveniente se traduce en una disminución de la resolución dado que las bandas se encuentran más juntas entre sí, siendo desaprovechada la mitad inferior del gel. También se observa una mala tinción del gel, lo cual puede deberse a un mal estado del colorante Coomassie Blue o errores experimentales de la misma.

• Como era de esperarse, se logra apreciar una gran cantidad de proteínas (chorreado) en la calle correspondiente al EC1.

• En la calle donde se sembró FT2, que corresponde a la fracción no retenida en la resina, nótese prácticamente nula la presencia de proteínas correspondientes al PM de la lisozima 14, 2 kDa.

• En la calle correspondiente al 1er lavado (L12), se aprecia en buena cantidad varias proteínas de pesos moleculares mayores a la que correspondería a la lisozima, como es el caso de una banda de 66KDa (BSA), y otra que corresponde a 45KDa (Ovoalbúmina) lo cual es prueba de la eficiencia del mismo e importancia para la purificación.

• En el 2do lavado (L22), no se logra observar con exactitud la presencia de banda alguna, por lo que no se puede afirmar que se trate de un lavado efectivo o necesario, aquí una sustancial purificación de la lisozima se encuentra ligada a un alto coste del rendimiento global.

• En vista de los resultados obtenidos en el gel en las fracciones anteriores, es lógico asumir que no se encontrarán cantidades significativas de impurezas en la calle E2, pero aunque se aprecia una banda correspondiente a la de la lisozima (14,2KDa) también las hay de otros PM como por ejemplo una banda correspondiente al PM de Ovoalbúmina, dejando en claro que la muestra deseablemente pura se encuentra en realidad muy contaminada. Esto se explica debido a un error en la manipulación de las fracciones obtenidas durante el laboratorio “Purificación de la Lisozima” (II), donde la muestra recién obtenida E, fue trasvasada al tubo falcon en el cual previamente se encontraba el EC (y aún quedaban remanentes del mismo).

I-b) Cuantificación de proteínas:

Para realizar una curva de calibración de proteínas con un testigo de BSA de concentración conocida, se colocan en tubos eppendorf distintos volúmenes del mismo (incluidas en el rango de sensibilidad del método), dado en µg de proteínas (1-12 µg), con agua y el colorante Azul Brillante de Coomassie, todos a un volumen final igual para luego medir absorbancia en un espectrofotómetro a 595nm. Se realiza por duplicado.

Tabla de datos

µL de BSA [BSA]=0,1 µg/µL µL de H20 µL de Azul de C. µg de BSA Abs1 (UA) Abs Corregida(UA) Abs2 (UA) Abs Corregida(UA)

0 700 700 0 0,322 0 0,351 0

10 690 700 1 0,383 0,061 0,377 0,026

20 680 700 2 0,399 0,077 0,416 0,065

40 660 700 4 0,473 0,151 0,494 0,143

60 640 700 6 0,531 0,209 0,553 0,202

80 620 700 8 0,578 0,256 0,625 0,274

100 600 700 10 0,638 0,316 0,679 0,328

120 580 700 12 0,684 0,362 0,702 0,351

Gráfica

Luego de realizar dos graficas con y sin el punto de 12µg de BSA, se decide realizar la curva de calibración sin este último porque si se lo tiene en cuenta se observa una disminución en la linealidad de la recta, es decir, no cumple con la linealidad de la Ley de Beer.

Con el punto de 12 µg:

Sin el punto de 12 µg:

Finalmente definimos el rango de absorbancia permitido para la cuantificación de proteínas de clara de huevo por Bradford: 0,041<Abs<0,329.

Para la purificación de la lisozima de la clara de huevo se realiza una cromatografía de intercambio catiónico en una resina de Carboximetilcelulosa a pH 10. Debido a que el pI de la lisozima es de 11, al pH de trabajo, la proteína de interés tiene carga neta positiva, interacciona con la resina quedando retenida en ella. Esto permite separarla del resto de las proteínas ya que a ese pH la proteína lisozima es prácticamente la única con carga positiva neta.

Cuantificación por método de Bradford

Se realizan medidas de absorbancia a 595nm por el método descripto anteriormente, por duplicado de todas las fracciones obtenidas en la purificación. Se utiliza la ecuación lineal de la regresión obtenida con el testigo de BSA para el cálculo de la concentración de lisozima.

Tabla y resultados

Fracción

Volumen (µL)

Volumen de H20 (µL)

Volumen de Bradford (µL)

Abs 1

Abs

2

Abs’ 1

Abs’ 2

Abs’ promedio

Desviación Estándar

Concentración de proteínas (mg/mL)

Banco 0 700 700 0,347 0,370 0 0 0 0,00 0,00

EC(DIL1/50) 20 680 700 0,589 0,584 0,242 0,214 0,228 0,02 17,13

FT(DIL 1/50) 20 680 700 0,642 0,649 0,295 0,279 0,287 0,01 21,73

L1 5 695 700 0,474 0,464 0,127 0,094 0,1105 0,02 0,64

L2 20 680 700 0,496 0,560 0,149 0,190 0,1695 0,03 0,25

E 20 680 700 0,655 0,687 0,308 0,317 0,3125 0,01 0,47

Cálculo de la concentración:

Ecuación utilizada:

Abs’promedio = 0,032 µg + 0,0089

Masa proteína = Abs´prom – 0,0089

0,032 µg

Ejemplo:

Fracción EC:

Masa proteína = 0,228 – 0,0089 = 6,85 µg

0.032 µg

6,85 µg _______20 µL

0.3425 mg =342,5 µg =______1000 µL

(Dil 1/50) 0.3425 mg x 50=17, 13 mg/mL

[EC]= 17,13 mg/mL

Cuantificación de proteínas por Absorbancia a 280nm

Se colocan 700µL de la fracción E en una cubeta especial para UV y se mide absorbancia a 280nm en el espectrofotómetro.

AbsEC 280nm= 1,276

Calculo de la concentración:

A través de la ecuación de Lambert-Beer, con un coeficiente de extinción molar teórico, el cual no es experimental sino una suma de los coeficientes de los grupos de los aminoácidos de la lisozima que absorben a 280nm:

Abs=ε.C.L

C=Abs/ ( ε.L)=1,276/(38,940cm-1mM-1.1cm)=0,0328 Mm

1m mol lisozima______________14200mg

0,0328mmol______________x=465,76mg

465,76mg_______________1000mL

0,466mg=x_______________1mL

Concentración de lisozima: [E]= 0,466mg/mL

Comparando esta concentración de proteína proveniente de la fracción E con la obtenida por el método de absorbancia a 595 nm (0.47 mg/ml) vemos que se obtuvo aproximadamente un valor igual, dando indicio de que en esta fracción se encuentra lisozima pura, lo cual se sabe que no es así debido al error cometido en la manipulación de los tubos y a los resultados obtenidos en la corrida electroforética.

I-c) Medida de la actividad de las distintas fracciones de la purificación:

Se mide en forma continua el descenso de la absorbancia a 600nm durante un periodo de 3 minutos, anotando la absorbancia cada 20 segundos en un fotocolorímetro Andali, de distintos volúmenes de cada fracción, utilizando como sustrato una suspensión bacteriana de Bacillus Subtilis y a un pH=6,2.

Gráfica de Abs 600nm vs. Tiempo en min de las distintas fracciones:

Con las pendientes de cada recta obtenemos los ΔAbs/min para calcular las actividades en U/ml:

Ejemplo de cálculo de la actividad para EC.

1 U _________ 0,001 Abs /min

67,7 U= x_____0,0677 Abs/min

67,7 U _______0,09 ml

752,22 U = x __1 ml

Fracción ΔAbs/min Act (U) Vol

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