PURIFICACIÓN DE LA LISOZIMA DE LA CLARA DE HUEVO DE GALLINA

PURIFICACIÓN DE LA LISOZIMA DE LA CLARA DE HUEVO DE GALLINA

1. ABSTRACT

This article describes a lysozyme purification attempt with the objective of propose a new and better method of purification. Lysozyme is an enzyme which causes hydrolysis of bacteries cell wall. First of all, the egg white has been subjected to an acid treatment and then to a thermal treatment. After that, 2 chromatography have been carried out comparatively. Results of this chromatography and of a following activity assay has been studied with a purification table and a PAGE-SDS electrophoresis for each type of chromatography. In both chromatography, results has been so similar, we have achieve a higher degree of purity but not a total purification because our final volume contains another proteins like ovoalbumin and conalbumin. In conclusion, we have proposed that the best method for obtain a pure lysozyme is to combine both chromatography.

1. INTRODUCCIÓN

La lisozima (EC 3.2.1.17) es una enzima bacteriolítica monomérica que posee una única cadena polipeptídica de 129 residuos unidos por 4 enlaces disulfuro. Se trata de una proteína globular, resistente a medios ácidos y altas temperaturas y soluble en agua o soluciones salinas débiles, cuya masa molecular es de 14300 dalton (Da) y su punto isoeléctrico de 10.7, es decir, se trata de un proteína básica [1]. La lisozima posee un papel importante en el mecanismo de defensa bacteriana ya que se encarga de la lisis de los peptidoglicanos de la pared celular de las bacterias, en concreto, hidroliza el enlace β (1→4) entre el ácido N-acetil-murámico y el N-acetil-D-glucosamida [2]. Puesto que las bacterias Gram positivas poseen un mayor porcentaje en peptidoglicanos (40-90%) que las Gram negativas (10%), su efecto es más importante en las bacterias Gram positivas [3].

La lisozima forma parte de un mecanismo de defensa innata que proporciona una barrera temprana contra las infecciones bacterianas, además puede inactivar ciertos virus formando un complejo insoluble y modular la inmunidad contra agentes bacterianos y virales [3]. Esta enzima compone un 3.5% de las proteínas de la clara del huevo [1], pero no solo está presente en el huevo, sino que debido a sus propiedades de defensa anteriormente explicadas, se halla muy distribuida por los fluidos del cuerpo; lágrimas, saliva, leche materna, sudor…[3]

Una vez definidas las propiedades de la lisozima, nuestro objetivo del ensayo será hallar un método eficaz de purificación de esta lisozima a partir de un huevo de gallina. Para ello se harán 2 cromatografías; una de exclusión molecular y otra de intercambio iónico, de forma independiente para obtener la lisozima lo más purificada posible, comparando al final del procedimiento qué método es más eficaz y proponer posibles mejoras para mejorarlo.

1. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

• Clara de huevo de gallina
• Tampón fosfato potásico 0.1M pH 6.6
• Tampón fosfato potásico 0.6M pH 6.6
• Tampón fosfato potásico 1M pH 7
• Ácido acético
• Sephadex
• Amberlita CG-50
• Paredes de bacterias Gram positivas
• Reactivo de Bradford
• Disolución de BSA 0.2 mg/ml
• Temed
• Azul de Coomasie
• Gel para PAGE - SDS

Purificación

Para hacer la purificación, en primer lugar se separó la clara del huevo, obteniendo un volumen de clara de 34 mililitros (mL), a continuación se diluyó con 102 mL de ácido acético 1M y se agitó durante 5 minutos. Se filtró y se recogieron 16 mL del filtrado, los cuales se centrifugaron durante 5 minutos a 4500 revoluciones por minuto (rpm) obteniendo muy poco sedimento blanco y un volumen E1 de sobrenadante de 15mL. A continuación se cogió una alícuota de 1mL de este volumen y el resto se incubó a 60ºC durante 5 minutos. Después se volvió a centrifugar en las mismas condiciones y hayamos sedimento blanco y un volumen E2 de sobrenadante de 13mL, del cual también guardamos una alícuota de 1 mL.

Cromatografías

Se realizó una cromatografía de intercambio iónico [4] en Amberlita CG- 50 para separar los compuestos según su carga. Para ello, se añadieron 2.4 mL de tampón fosfato potásico 1.0M pH 7.0 al volumen restante de E2 y se aseguró que el pH era de 6.5. Se cargó la muestra en la cromatografía y con tampón fosfato potásico 0.1M pH 6.6 se procedió al lavado, pasando unos 140 mL del dicho tampón y recogiendo fracciones de 10 mL. Más tarde se midió la absorbancia a 280nm de cada fracción. A continuación se usó tampón fosfato potásico 0.6M pH 6.6 para extraer las proteínas retenidas en la columna. Se pasaron unos 60–70 mL y se recogieron fracciones de 3 mL, midiendo la absorbancia a 280 nanometros (nm) de cada fracción.

Por otra parte, otros compañeros con su volumen E2 realizaron una cromatografía de exclusión molécular [4] en Sephadex G-75 en modo comparación. Para ello se aplicó 1mL del volumen de E2 en la columna y se utilizó ácido acético 0.1M para hacer pasar la muestra hasta haber hecho pasar un 20% del volumen más del volumen total de la columna. Se recogieron 35 fracciones de 2mL cada una y posteriormente, se midió su absorbancia a 280 nm.

Ensayo enzimático

A continuación, con el objetivo de conocer en qué fracciones se encuentra nuestra lisozima, se llevará a cabo un ensayo enzimático [5]. Para ello utilizaremos una suspensión de paredes de bacterias Gram positivas que son hidrolizadas por la lisozima, de forma que la densidad óptica inicial de las paredes medida en un espectrofotómetro, al añadirle una alícuota de una fracción, si hay enzima presente en dicha fracción, disminuirá. Se miden en UAL de cada fracción, lo cual se define como la cantidad de enzima capaz de producir una disminución en la densidad óptima a 450 nm de 0.001 por minuto.

[pic 1]

Ecuación 1. Ecuación mediante la cual se mide la actividad de cada fracción de la cromatografía

El procedimiento consistió en medir la absorbancia control de la suspensión de paredes de bacterias Gram positivas a 450 nm, se añadían 0.2 mL de muestra de una fracción, se disparaba el cronómetro y se agitaba. Después se insertaba la muestra de nuevo en el espectrofotómetro y se medía la absorbancia a 450 nm cada 30 segundos y hasta los 3 minutos. Esto se hizo con fracciones claves recogidas en las cromatografías. Las fracciones que presentaron actividad, se juntaron consiguiendo un volumen de E3 de 31 mL. El mismo proceso se llevó a cabo con los volumenes E1, E2 y E3, hayando así su actividad (ecuación 1).En algunos casos fue necesario diluir las muestras, ya que las representaciones de absorbancia frente a tiempo no eran lineales.

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