Recuento De Indicadores De Contaminación Fecal En Agua Mediante Filtración Por Membrana

 Introducción

Los cauces de agua natural tales como ríos, lagos y arroyos, contienen suficientes nutrientes para soportar el crecimiento de varios organismos, que entran en el abastecimiento de agua de diferentes formas. En sitios congestionados, por ejemplo, los suministros de agua se contaminan por residuos domésticos e industriales. Como potencial portador de microorganismos patógenos, el agua puede poner en peligro la salud.

El agua potable se obtiene de diferentes fuentes, como pozos, ríos y aguas superficiales. Diversas impurezas, desde ramas de árboles hasta microorganismos invisibles, pueden estar presentes en estas aguas y necesitan ser eliminadas antes de que el agua sea suministrada al público. Para ello, es necesario analizar el agua y garantizar la seguridad de ésta para ser consumida, dentro de estas determinaciones se encuentra filtro por membrana, la cual está establecida como método estándar normalizado.

Los gérmenes patógenos presentes en el agua se encuentran, generalmente, en cantidades muy bajas, comparadas con las de las bacterias normales de la flora intestinal. Además, estas últimas, como las de grupo coliforme, son más fáciles de aislar- e .identificar, por lo que se usan como indicadoras de contaminación de origen fecal. Como la contaminación es casi siempre intermitente, es importante el análisis periódico de muestras, como-también la selección de los puntos de muestreo.

Otros microorganismos utilizados como indicadores de contaminación fecal son. Estreptococos fecales, Clostridium perfringens, Bifidobacteria y Bacteriófagos fecales (por ejemplo, colifagos).

La prueba de filtro por membrana es altamente reproducible, puede utilizarse para estudiar volúmenes relativamente grandes de muestra y proporciona resultados numéricos más rápidos que el método de los tubos múltiples (determinación de coliformes fecales mediante el NMP). Este método es muy útil para controlar las posibles situaciones de urgencia en relación con el agua potable y para estudiar distintas aguas naturales.

Dentro de las ventajas que podemos encontrar en este método para la determinación de coliformes fecales en aguas naturales, residuales e industriales.

* Rapidez en la obtención de resultados.

* Ahorro de mano de obra, medios de vidrio y coste de los materiales si el filtro se lava y se vuelve a utilizar.

Inconvenientes de Uso:

* No hay indicación de formación de gas (algunas H2O tienen gran cantidad de organismos fermentadores de la lactosa sin producción de gas capaces de crecer en el medio).

* La filtración por membrana es inadecuada para H2O con mucha turbidez y bajos recuentos, porque el filtro llega a obturarse antes de que pase agua suficiente.

* Cantidades grandes de organismos no coliformes capaces de crecer en el medio pueden interferir en el crecimiento de los coliformes.

Sin embargo, esta técnica tiene limitaciones sobre todo para estudiar aguas con elevada turbidez o que contengan bacterias no coliformes. Para estas aguas y también en caso de que se haya utilizado anteriormente la técnica del filtro de membrana, es preferible llevar a cabo pruebas paralelas mediante la técnica de fermentación de tubos múltiples para la demostración de la aplicabilidad y comparabilidad.

1. Para exámenes efectuados en porciones de 10 ml:

-En general, en muestras normales, de las porciones que se examinan mensualmente- (dependiente del número de habitantes abastecidos), un número inferior o igual al 10% de ellas podrá indicar la presencia de bacilos coliformes (salvo casos ocasionales).

2. Si se aplica la técnica de la membrana filtrante, la media aritmética de la densidad coliforme de todas las muestras normales por mes debe ser inferior o igual a un germen coliforme por 100 ml. Igualmente el número de colonias r coliformes por muestra normal debe ser inferior o igual a 3 en 50 ml, a 4 en 100 ml, a 7 en 200 ml, o a 13 en 500 ml.

Técnica de filtración por membrana para CT (FM). Se basa en la capacidad de los coliformes totales de desarrollar colonias de color rojo oscuro; con brillo metálico; cuando se incuban en medio m-Endo, durante 24 horas, a 35 °C . La enumeración de coliformes totales por FM se realiza en una etapa, filtrando un volumen adecuado de muestra por un filtro de membrana estéril con un tamaño de poro de 0,45 micrones e incubando luego el filtro en ambiente húmedo en caldo m-Endo más 1,5% de agar o agar m-Endo LES. Se deben elegir volúmenes, de modo de obtener entre 20 y 80 colonias en la placa. Los resultados se expresan como colonias de coliformes totales por 100 ml.

Técnica de filtración por membrana para CF (FM). Se basa en la capacidad de los coliformes fecales de desarrollar colonias azules cuando se incuban en medio m-FC a 44 °C durante 24 horas. La enumeración se realiza en una etapa, filtrando un volumen adecuado de muestra por un filtro estéril, de porosidad promedio de-0,7 micrones. Se sigue igual que para los coliformes totales, pero con las siguientes modificaciones:

- El medio de cultivo usado es caldo m-FC.

- Debe filtrarse un volumen de muestra, de modo que el número ideal de colonias en la membrana sea de 20-60, dentro de un máximo de 200.

- Las placas que contienen las membranas se incuban en baño termo-reguladode 44,5 ± 0,2°C, dentro de recipiente cerrado (bolsa plástica) sumergido en el agua del baño. - El tiempo desde la filtración hasta la incubación no debe superar 30 min.

-Deben contarse como coliformes fecales las colonias azules; si aparecen coliformes no fecales dan colonias de color gris o crema.

 Material y Sustancias

o Muestra de agua de diversa naturaleza, de no menos de 100 mL.

o Equipo de filtración Millipore estéril.

o Bomba de vacío.

o Pinzas Millipore de punta plana.

o Mechero Bunsen.

o Cerillos ó encendedor.

o Gradillas.

o Pipetas de 10 mL graduadas en mL y 1 mL graduadas en décimas, estériles.

o Cuentacolonias Quebec.

o 6 membranas de filtración Millipore cuadriculadas, estériles.

o 4 Tubos de ensayo conteniendo 9 mL de agua de dilución estéril, cada uno.

o Cajas Petri por triplicado conteniendo los siguientes medios de cultivo: m-Endo LES, AGAR m-FC, KF-Streptococcus, Sulfito-Polimixina-Sulfadiazina (SPS), Agar Triptona Soya (TSA), Infusión de Cerebro y Corazón Agar (BHIA) y agar de Bilis y Esculina (BEA).

o Solución al 1% de Oxalato de p-aminodimetilanilina, para Prueba de Citocromo-Oxidasa.

o Discos impregnados de o-nitrofenol-ß-D-Galactopiranósido (ONPG), para disolver en 0.2-0.5 mL de suero fisiológico, para Prueba de la ß-Galactosidasa.

o Vaso con 50 mL de alcohol.

o Probeta de 100 mL estéril.

o Solución acuosa de Peróxido de Hidrógeno de 10 volúmenes, para Prueba de la Catalasa.

 Técnica

De acuerdo al tipo de muestra asignada a cada equipo de alumnos deberá, seguir

la metodología correspondiente, que comprende las siguientes etapas:

1. DETERMINACION DEL VOLUMEN A ANALIZAR

Fundamento:

Cada filtración nos permite efectuar recuentos dentro de unos límites determinados de carga microbiana.

Es preciso ajustar el volumen a filtrar para que, en la medida de lo posible, pueda situarse dentro de esos límites.

Para cada tipo de muestra se presupone una cantidad de carga microbiana más o menos determinada.

Este hecho da una orientación a la hora de escoger los volúmenes que es necesario analizar.

Sin embargo, si la muestra ya ha sido analizada con anterioridad, se utiliza preferentemente esa información para escoger las alícuotas a filtrar.

Procedimiento:

Según los límites de recuento para cada indicador y el tipo de muestra se escoge el volumen a filtrar.

2. FILTRACION

La población bacteriana contenida en un volumen conocido de agua se concentra al ser retenida en una membrana filtrante.

El mecanismo de filtración ha de asegurar una distribución homogénea de esa población por toda la superficie de la membrana.

Utilizando el mismo embudo para cada muestra se efectúan las filtraciones para cada indicador.

Si hubiera que efectuar diluciones para obtener alguna alícuota, se empieza filtrando la más diluida.

Entre muestra y muestra, se deberá cambiar ó esterilizar el embudo.

3. INCUBACION

A continuación la membrana se deposita sobre el medio selectivo-diferencial adecuado y se incuba en las condiciones propias del grupo en estudio en ese medio.

Incubar cada medio según la Tabla 21.2.

4. RECUENTO

La superficie filtrante es, a la vez, la superficie de cultivo y constituye una limitación para el desarrollo colonial a partir de un determinado número de U.F.C. por placa.

El tamaño de las colonias también acota el número máximo de éstas que puede albergar una membrana filtrante.

En consecuencia, para cada medio de cultivo y cada microorganismo se establece un recuento máximo admisible según el tamaño de la superficie filtrante.

Por encima de este valor no se desarrollan todos los microorganismos que pretendemos recontar y las colonias obtenidas no mostrarán plenamente la morfología diferencial deseada.

Asimismo, y debido a la variabilidad estadística de

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