Recuento De Enterococos Intestinales Con Confirmación. Filtración De Aguas De Consumo.

PNT: Recuento de Enterococos intestinales con confirmación. Filtración de aguas de consumo.

CONTROL Y ANÁLISIS DE ALIMENTOS

Enero 2012 PNT: Recuento de Enterococos intestinales con confirmación. Filtración de aguas de consumo. REV 0

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ÍNDICE:

1. OBJETO

2. ALCANCE

3. REFERENCIAS

4. GENERAL

5. PROCEDIMIENTO OPERATIVO

a. Fundamento

b. Aparatos y materiales

c. Medios de cultivo y reactivos

d. Preparación de medios de cultivo y reactivos

e. Preparación de muestras

f. Calibración y manejo de aparatos

g. Procedimiento operativo de análisis

h. Cálculos y expresión de resultados

i. Observaciones y puntos críticos.

6. CONTROL DE CALIDAD. VALIDACIÓN

7. PROCEDIMIENTOS RELACIONADOS

8. MEDIDAS DE SEGURIDAD

9. LÍMITES LEGALES APLICABLES

10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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1. OBJETO:

Detección y recuento de Enterococos intestinales en agua de consumo como indicadores de contaminación.

2. ALCANCE:

Este método es aplicable a aguas de consumo humano.

Para valores comprendidos entre 4 y 100 ufc/100 ml.

3. REFERENCIAS:

Calidad del agua: Detección y recuento de Enterococos intestinales.

Parte 2: Método de filtración por membrana. UNE-EN ISO 7899-2 Mayo 2001.

Calidad del agua: orientaciones generales para el recuento de microorganismos en cultivo. UNE-EN ISO 8199 Mayo 2008.

Calidad del agua. Muestreo para el análisis microbiológico. UNE-EN ISO 19458 Abril 2007.

4. GENERAL:

Son aquellas bacterias cocáceas, Gram positivas, aerobias o anaerobias facultativas y catalasa negativas capaces de reducir el cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) a formazan y de hidrolizar la esculina.

El método utilizado es el de filtración por membrana con recuento de las colonias características que crecen sobre un método selectivo, Medio Agar selectivo para enterococos (para filtración de membrana) según Slanetz y Bartley y su confirmación en un medio específico.

5. PROCEDIMIENTO OPERATIVO:

a. Fundamento:

Determinación del número de Enterococos mediante filtración de volúmenes determinados del agua a analizar, por filtros de membrana de 0,45 micrómetros de porosidad suficiente para retener las bacterias e incubación sobre medio de cultivo con azida sódica (destinada a inhibir el crecimiento de las bacterias Gram

negativas) y cloruro de 2,3,5-trimetiltetrazolio como indicador incoloro, que se reduce a formazan, rojo, por acción de Enterococos.

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Después de la incubación a 36ºC +/-2ºC durante 44+/- horas, todas las colonias desarrolladas que presenten color rojo, marrón o rosa, en su centro o por toda ella, se cuentan como Enterococos presuntivos. Se confirman por transferencia de la membrana sobre una placa con medio Agar biliado con esculina y con o sin azida, incubando a 44ºC +/- 0.5ºC durante 2 horas. Los Enterococos hidrolizan la esculina con producción de dihidroxicumarina que se combina con los iones hierro (III) formando un compuesto de color marrón a negro que se difunde por el medio.

b. Aparatos y Materiales:

1. Rampa de vacío con soportes de filtración de acero inoxidable y válvulas de control de vacío.

2. Estufa a 36ºC +/- 2ºC.

3. Estufa 44ºC +/- 0,5ºC

4. Mechero bunsen

5. Autoclave a vapor fluente

6. Pinzas flameables de extremos planos.

7. Membranas filtrantes de ésteres de celulosa de 0,45 micras de porosidad, 47 mm de diámetro y estériles.

8. Embudos estériles de 60 mm de diámetro.

9. Pipetas estériles de 10 ml +/- 0,5 ml.

c. Medios de cultivo y reactivos:

Medio selectivo: Agar selectivo para Enterococos (filtración por membrana) según Slanetz y Bartley. Merck. También podremos usar Slanetz and Bartley Agar de Scharlau. El pH deberá ser 7,2 +/- 0,2 a 25ºC.

Composición:

1. Triptona: 20,0g

2. Extracto de Levadura: 5,0g

3. D(+) glucosa: 2,0g

4. Hidrogenofosfato di-potásico: 4,0g

5. Azida sódica: 0,4g

6. Agar-Agar: 10,0g

7. Cloruro de trifenil-2,3,5 tetrazolio 1%: 0,1g.

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Medio de confirmación:

Enterococcosel Agar.

El pH deberá ser 7,1 +/- 0,2 a 25ºC.

1. Bilis de buey: 10g

2. Citrato férrico amónico: 0,5g

3. Esculina: 1,0g

4. Digerido péptico de tejido animal: 3,0g

5. Digerido pancreático de caseína: 17 g

6. Extracto de levadura: 5g

7. Cloruro sódico: 5g

8. Azida sódica: 0,25g

9. Citrato sódico: 1g

10. Agar: 13,5g

Diluyente:

Solución de peptona salina: Bacto peptona BDL; cloruro sódico para análisis. Merck.

El pH se debe ajustar a 7,0 +/- 0,2.

1. Cloruro sódico: 8,5g

2. Peptona: 1,0g

3. Agua: 1000ml.

d. Preparación de Medios de cultivo y Reactivos.

Agar selectivo para enterococos (para filtración por membrana) según Slanetz y Bartley, dosificado en placas de 60nm de diámetro, con un espesor de 3 a 5 mm y caducidad en 2 semanas. También podremos usar Agar selectivo para enterococs ya preparado en placas de 60mm.

Enterococcosel Agar. Medio comprado preparado en placas de 100mm de diámetro.

Solución peptona salina preparada en frascos con 200ml.

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f. Preparación de las muestras:

f.1.Condiciones de la muestra:

Una vez recepcionada la muestra se comprobará si en el envase se indica su tratamiento con tiosulfato. En su defecto será rechazada dicha muestra.

Volumen mínimo: 250ml.

Tipo de recipiente: envase estéril.

Tiempo de análisis: Una vez recibida la muestra en el laboratorio deberá iniciarse antes de que transcurran 6 horas de la toma o mantenerse en cámara frigorífica a 5ºC +/- 3ºC, procediendo a su análisis antes de 18 horas. En circunstancias excepcionales, es admisible conservar las muestras a 5ºC +/- 3ºC, durante un tiempo máximo de 24horas, antes de su análisis.

f.2.Preparación de la muestra en el laboratorio:

Antes de proceder a la apertura de los envases, se desinfecta el cuello y el tapón. Si es de vidrio se efectuará a la llama, si es de otro material se realizará con alcohol u otro desinfectante.

Una vez abierto se esteriliza la boca u obertura a la llama, si es posible. Si se trata de un tetrabrick o bolsa de material polimérico, se flamean previamente las tijeras o instrumentos para abrir el envase.

Agitar en distintas direcciones un mínimo de 25 veces con objeto de homogeneizar la muestra antes de proceder a su análisis.

g. Calibración y manejo de aparatos:

Manejo correcto de rampa de filtración.

h. Procedimiento operativo de análisis:

Colocar un filtro de membrana estéril sobre el soporte de filtración de acero, este último flameado durante 3 segundos, utilizando pinzas igualmente flameadas. Adaptar el embudo estéril sobre el soporte. Verter la muestra e el embudo una vez homogeneizada y aplicar el vacío para que el líquido se filtre.

Los volúmenes de muestra a filtrar comprendidos entre 30 ml y 100 ml se añaden directamente al embudo de filtración.

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Filtrar 100 ml +/- 5 ml de agua de consumo previamente homogenizada. Cuando se obtenga

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