Separación de orgánulos celulares

UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE HIDALGO[pic 1]

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INSTITUTO DE CIENCIAS BÁSICAS E INGENIERÍA

ÁREA ACADEMICA DE BIOLOGÍA

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

Reporte de práctica 4 Permeabilidad y fenómenos dinámicos de la membrana

Carrillo Luna Edwin Alejandro

Juárez Martínez Nely 347655

Márquez Campos Axel 346953

Saucedo Hernández Melvin 183185

axelmc923@gmail.com, melvinsaucedo50@gmail.com.

Ciudad del Conocimiento. Carretera Pachuca–Tulancingo Km. 4.5 s/n

Col. Carboneras. Mineral de la Reforma, Hidalgo.        

Resumen

Durante el estudio de la biología celular es indispensable observar estructuras y determinar las funciones particulares de los organelos celulares para esto se requiere una separación diferencial para su estudio de forma independiente mediante métodos de centrifugación diferencial lo cual consiste en separar los distintos organelos de acuerdo a su tamaño y densidad se aislarán a ciertas (RPM), así lograr aislar pastillas de buen tamaño con mayor posibilidad de encontrar organelos celulares debido a que se aisló de la manera más pura que se pudo realizar, ya que de acuerdo al método que se llevó acabo la realización del procedimiento logro una fraccionamiento celular adecuado.

Introducción  

El aislamiento de estos complejos puede realizarse mediante el método de centrifugación diferencial, en la que de primera mano se realiza la lisis celular (comúnmente se realiza de forma mecánica). Después se procede a la separación de la fracción deseada, por centrifugación (Montero-Guevara, 2010).

La centrifugación es una técnica que tiene como fundamento los diferentes coeficientes de sedimentación de cada organelo celular o partículas a los cuales serán expuestos a determinada cantidad de energía centrifuga en gravedades para precipitar las sustancias. En la centrifugación celular, la muestra ya homogenizada es colocada en un tubo para ser centrifugada de nuevo con un número de revoluciones por minuto mayor a la inicial, en el cual el sobrenadante es desechado o a reserva dependiendo de los orgánulos que se deseen recuperar. Por otro lado, el pellet es suspendido y vuelve a centrifugarse. La centrifugación es una técnica de sedimentación, acelerada gracias al uso de fuerza centrífuga. Se aplica al análisis o a la separación de mezclas de partículas, células, orgánulos o moléculas (Luque y Herráez 2001).

En la centrifugación diferencial, el homogenado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades, sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas.Los cloroplastos de las células de espinaca se aislarán utilizando el método modificado de F.R Whatley y D.I.Arnon (1962). La fracción nuclear y mitocondrial de las células de las células de la coliflor se obtendrán utilizando una centrifugación diferencial escrita por W.D. Bonner (1967) (Bregman, 2016)

Las partículas más pesadas son las partículas que se precipitan primero (Stanfor, 1988).

Objetivo  

Mediante métodos de centrifugación diferencial aislar orgánulos tales como núcleos, cloroplastos y mitocondrias, para posteriormente diferenciar por microscopía la separación de las fracciones puras de los orgánulos.

Materiales y reactivos

Desarrollo experimental

 1.- A 4g de muestra vegetal, hojas de espinaca se le quito la nervadura, fue homogenizada en frío, se le agregó 15 mL de Lisis I, fue macerada por 5 minutos, posteriormente filtrada con una gasa húmeda. Luego se centrifugó a 1000 rpm durante 10 minutos, fue decantado el sobrenadante y éste a su vez se centrifugó a 3500 rpm por 15 minutos. Posteriormente fue sacada una medida A-B con referencia al pellet.

Después se le  agregaron 3mL de suero fisiológico, 3mL de lisis I y 4 gotas de glicerol para su conservación.

2.-  Se tomaron 4g de tejido animal (hígado de pollo) para ser homogenizado. Fue triturado con mortero en frío y se fue agregado 15mL de  solución de lisis II, fue filtrado con gasa húmeda para ser centrifugada a 2500 rpm durante 10 minutos.  

Se decantó el sobrenadante, que le fue agregado nuevamente solución de lisis II y se centrifugó a 9300 rpm por 10  minutos más; el pellet fue almacenado con 3mL suero fisiológico y cuatro gotas de glicerol.

Resultados

Mitocondrias:

Mediante la utilización de Hidrogeno líquido y con la ayuda de un mortero fueron triturados unas hojas de espinaca, para posteriormente utilizar solución de lisis I fría.

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                        [pic 3]

Posteriormente se realizó una centrifugación del material obtenido, una vez que se hizo esta centrifugación se decantó el sobrenadante y se realizó un asegunda centrifugación con el objetivo de poder separar los cloroplastos de los demás orgánulos ya que las revoluciones y el tiempo de centrifuga determinaran los orgánulos que deseamos obtener ya que cada uno de ellos se precipita o queda como sobrenadante y así posteriormente realizar un estudio  más detallado de cada uno de ellos.

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Resultado de la primera centrifugación                     Resultado de la segunda centrifugación

Una vez efectuadas las centrifugaciones se descarta el sobrenadante para poder conservar el pellet el cual se coloca en un micro tubo para su posterior conservación.

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Tejido animal:

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Esta imagen nos muestra el pesaje del tejido animal, del cual se pesaron 4g.

Cabe destacar que se utilizó corazón de pollo para llevar a cabo esta práctica

Fig. 1 Pesando el tejido animal [pic 8]

Para llevar a cabo este paso se enfrió el mortero con hielos y se agregó el corazón de pollo para poderlo homogenizar, esto se llevó a cabo durante unos 15 min debido a que no se utilizó nitrógeno líquido.

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