TALLER DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS (BIOLOGIA MOLECULAR Y GENETICA)

TALLER DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

(BIOLOGIA MOLECULAR Y GENETICA)

LABORATORIO

LIC. DIANA MOLINA

ALUMNOS:

KATERIN CHAVARRIAGA

SARAI HERNANDEZ

 ISMAEL EPIAYÚ

BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO

TERCER SEMESTRE

UNIVERSIDAD DE SANTANDER

VALLEDUPAR-CESAR

2022

1- Extracción de ADN a partir de una muestra de Klebsiella pneumoniae, utilizando el

Protocolo adjunto. Debe indicar:

a--Nombre de la casa comercial:

Promega

b- Tipos de muestra para extraer ADN.

• Tejidos.
• Líquidos biológicos.
• Secreciones.
• Aislamiento de ADN genómico a partir de sangre total.
• Aislamiento de ADN genómico de sangre completa.
• Aislamiento de ADN genómico de sangre completa.
• Aislamiento de ADN genómico a partir de células de cultivo tisular y tejido animal.
• Aislamiento de ADN genómico a partir de tejido vegetal.
• Aislamiento de ADN genómico de levadura.
• Aislamiento de ADN genómico de bacterias grampositivas y gramnegativas.

c-Nombre de los Reactivos y función de cada uno

• KIT Wizar Genomic-PROMEGA:

Está diseñado para el aislamiento de ADN de glóbulos blancos, células de cultivo de tejidos y tejido animal, tejido vegetal, levadura, y bacterias Gram positivas y Gram negativas.

Se basa en un proceso de cuatro pasos . El primer paso en el procedimiento de purificación lisa las células y los núcleos. Para el aislamiento del ADN de los glóbulos blancos, este paso implica la lisis de los glóbulos rojos en la solución de lisis celular, seguida de la lisis de los glóbulos blancos y sus núcleos en la solución de lisis de núcleos. En este momento se puede incluir un paso de digestión con RNasa; es opcional para algunas aplicaciones. Luego, las proteínas celulares se eliminan mediante un paso de precipitación con sal, que precipita las proteínas pero deja el ADN genómico de alto peso molecular en solución. Finalmente, el ADN genómico se concentra y desaliniza por precipitación con isopropanol.

• kit -Biolabs:

El kit de purificación de ADN genómico Monarch es una solución integral para la lisis celular, la eliminación de ARN y la purificación de ADN genómico intacto (ADNg) de una amplia variedad de muestras biológicas, incluidas células cultivadas, sangre y tejidos de mamíferos. Además, las bacterias y la levadura se pueden procesar con pasos adicionales para mejorar la lisis en estas muestras difíciles de lisar. También se incluyen protocolos para permitir la purificación de muestras clínicamente relevantes, como hisopos de saliva y mejillas, así como una limpieza rápida de gDNA extraído previamente.

d- Instrumentos y equipos

• Lapicero Sharpie punta delgada.
• Gradilla y Tubos eppendorf.
• Cajas para guardar ADN.
• Cultivo bacteriano.
• Kit de extracción de ADN.
• Isopropanol frio.
• Etanol 70%
• Guantes de nitrilo.
• Micropipetas.
• Microtubos.
• Puntas con filtro.
• Centrifuga.
• Vortex.
• Congelador.

e- Técnica para extracción de ADN de células bacterianas. Escriba el paso a paso indicando el orden utilizado para realizar la extracción en su práctica, según Protocolo adjunto.

• Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
• baño maría, 80°C.
• baño maría, 37°C.
• isopropanol, temperatura ambiente.
• Etanol al 70 %, temperatura ambiente a baño de agua, 65°C (opcional; para una rehidratación rápida del ADN).

1. Agregue 1 ml de un cultivo de toda la noche a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 2 minutos para sedimentar las células. Retire el sobrenadante.
3. Agregue 600 µl de solución de lisis de núcleos. Pipetear suavemente hasta que las células se vuelvan a suspender.
4. Incubar a 80°C durante 5 minutos para lisar las células; luego enfriar a temperatura ambiente.
5. Agregue 3 µl de solución de ARNasa al lisado celular. Invierta el tubo de 2 a 5 veces para mezclar.
6. Incube a 37 °C durante 15 a 60 minutos. Enfriar la muestra a temperatura ambiente.
7. Agregue 200 µl de solución de precipitación de proteínas al lisado celular tratado con RNasa. Vortex vigorosamente a alta velocidad durante 20 segundos para mezclar la solución de precipitación de proteínas con el lisado celular.
8. Incube la muestra en hielo durante 5 minutos.
9. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 3 minutos.
10. Transfiera el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml que contenga 600 µl de isopropanol de temperatura.

Nota: Es posible que quede algo de sobrenadante en el tubo original que contiene el sedimento de proteína. Deje este líquido residual en el tubo para evitar contaminar la solución de ADN con la proteína precipitada.

1. Mezcle suavemente por inversión hasta que las hebras de ADN parecidas a hilos formen una masa visible.
2. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 2 minutos.
3. Retire con cuidado el sobrenadante y escurra el tubo sobre papel absorbente limpio. Agregar 600 µl de temperatura ambiente Síntomas Coágulos de sangre presentes en muestras de sangre. etanol al 70 % e invierta suavemente el tubo varias veces para lavar el sedimento de ADN.
4. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 2 minutos. Aspirar con cuidado el etanol.
5. Drene el tubo sobre papel absorbente limpio y deje que el sedimento se seque al aire durante 10 a 15 minutos.
6. Agregue 100 µl de solución de rehidratación de ADN al tubo y rehidrate el ADN incubándolo a 65 °C durante 1 hora. Mezcle periódicamente la solución golpeando suavemente el tubo. Como alternativa, rehidrate el ADN incubando la solución durante la noche a temperatura ambiente o a 4 °C.
7. Guarde el ADN a 2–8 °C.

2- ¿Qué factores físicos y químicos puede utilizar para desnaturalizar las proteínas presentes en la muestra de estudio del ácido nucleico?

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