TRANSFERENCIA MEDIADA POR VECTORES DE BACULOVIRUS DE YODURO DE SODIO Y SYMPORTER PLASMINÓGENO KRINGLE 5 GENES DE RADIOYODO TERAPIA DEL TUMOR

TRANSFERENCIA MEDIADA POR VECTORES DE BACULOVIRUS DE YODURO DE SODIO Y SYMPORTER PLASMINÓGENO KRINGLE 5 GENES DE RADIOYODO TERAPIA DEL TUMOR

Tanto las células tumorales y sus células endoteliales de apoyo deben ser considerados para la eliminación de células objetivo en el diseño de tratamientos contra el cáncer. Aquí se investigó la posibilidad de combinar las terapias antiangiogénicas radio yoduro y después de la transferencia de baculovirus mediado de genes que codifican el cotransportador de yoduro de sodio (NIS) y plasminógenokringle 5 (K5).

MÉTODOS

Un baculovirus recombinante que contiene el gen NIS bajo el control del promotor de la telomerasa humana de la transcriptasa (hTERT) y el gen K5 impulsado por la respuesta de crecimiento temprano 1 atrás (Egr1)

El efecto apoptótico de  K5 inducida-I en las células endoteliales de la vena umbilical humana infectadas con baculovirus (HUVECs) se analizó mediante un ensayo basado en citometría de flujo. In vivo, el gen reportero de imágenes NIS y experimentos terapéuticos.

INTRODUCCION

La clonación del cotransportador de yoduro de sodio gen (NIS) han dado lugar a un nuevo enfoque de la terapia con yodo radioactivo blanco de los cánceres malignos.

GEN NIS:Es trasportador de Yodo. Es una glicoproteína de membrana que media la captación activa de un ion yoduro junto con dos iones de sodio a través de la membrana basolateral de las células foliculares de tiroides. La absorción de radio yoduro se puede conseguir mediante la expresión de la proteína NIS en células tumorales a través de la transferencia de genes mediada por vectores para destruir el tumor por emisión de rayos beta de I (Una partícula beta (β) es un electrón que sale despedido de un suceso radiactivo).

PROMOTOR DE GEN (hTERT): Es un componente importante de la telomerasa(se encuentran en los extremos de los cromosomas)que es altamente activo en la gran mayoría de los tumores malignos, pero es inactivo en la mayoría de las células normales.

Cuando hay actividad transcripcional del promotor del  gen HTERT y que este se encuentra activo o positivo en la telomerasa,  la terapia génica vector inducida por tipos de cáncer es adecuada para minimizar los tumores malignos cancerígenos.

PROMOTOR DE GEN (Egr1): Gen presente en los humanos que actúa como respuesta de crecimiento temprano en los tumores malignos, es también un promotor inducible por radiación, Egr1

GEN K5: es un gen o una expresion genética,

La formación de nuevos vasos sanguíneos en respuesta a la hipoxia es un acontecimiento fundamental en el proceso de crecimiento del tumor y la diseminación metastásica.

Algunos estudios han sugerido que los fármacos antiangiogénesis pueden mejorar la respuesta tumoral a la radioterapia o la terapia con radionucleidos.

El plasminógeno, que es una glicoproteína que está en el cuerpo humano  el cual contiene kringle, que es un gen que contiene 5 dominios y es la proteína precursora de un grupo de inhibidores angiogénicos (angiostatina consta de dominios kringle 1-4). Kringle 5 (K5), se ha demostrado que se induce  la apoptosis (muerte de las células endoteliales) pero cuando se combina con radiación ionizante  el efecto antitumoral puede mejorar.

El vector de expresión de baculovirus(derivado de virus de insectos)recombinante dual en el que los genes NIS y K5 son impulsados ​​por los promotores de hTERT y Egr1. Este baculovirus recombinante se utiliza para infectar las células tumorales y las células endoteliales tumorales e investigar la viabilidad de una estrategia que combina la terapia de radiación β a base de NIS y la terapia antiangiogénica basada en K5 inducida simultáneamente por yodo radiactivo.

METODOS Y MATERIALES

LÍNEAS CELULARES Y CULTIVOS CELULARES

Células humanas de cáncer cervical (HeLa), células de adenocarcinoma de pulmón humano (A549), células de glioma humano (U87), células de fibroblastos de pulmón fetal humano (MRC5) y venas umbilicales humanas células endoteliales (HUVEC) obtenidos a partir de la Academia de Ciencias de China.

TRANSFECCIÓN TRANSITORIA Y EL PROCEDIMIENTO DE ENSAYO DE INDICADOR

Las células cultivadas (Hela, A549, U87 y MRC5) se sembraron en placas de cultivo celular de 24 pocillos a densidades de 5 x 10 4 células / pocillo 24 h antes de la transfección

Las células se incubaron con 0,5 ml de medio que contiene mezcla de transfección durante 6 h, y se cambió el medio. La incubación se continuó durante un adicional de 18 h. A continuación, el medio se desecha y las células se lavaron dos veces con PBS. Las células en cada pocillo se recogieron para la luciferasa de luciérnaga y renillaluciferasa ensayo.

Dos actividades de luciferasa se determinaron secuencialmente por el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega). Todos los datos de actividad de luciferasa de luciérnaga se corrigieron para la actividad de luciferasa de Renilla para dar cuenta de la variación en la eficiencia de transfección y se expresan como un porcentaje de los resultados utilizando el control positivo.

PLÁSMIDO CONSTRUCCIÓN Y GENERACIÓN DE BACULOVIRUS RECOMBINANTE

El plásmido pGL3-hTERT-Luc, que lleva el gen de la luciferasa dirigido por el promotor de hTERT, fue proporcionado amablemente por Nicol Keith (Universidad de Glasgow, Glasgow, Reino Unido). El plásmido pGL3-Egr1-Luc, que contiene el gen de la luciferasa bajo el control del promotor Egr1, fue una especie de regalo de Gerald Thiel (Universidad del Sarre, Centro Médico, Homburg, Alemania). El plásmido pET22b-K5 (con cola de histidina) se construyó previamente en nuestro laboratorio. El vector de expresión pFastBac Dual basados ​​en baculovirus se adquirió de Invitrogen.

El baculovirus recombinante Bac-hTERT-NIS-Egr1-K5 se generó usando el sistema Bac-to-Bac (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Un baculovirus recombinante que expresa el gen NIS dirigido por el promotor CMV (Bac-CMV-NIS-Egr1-K5) se construyó como control positivo, mientras que los baculovirus recombinantes que expresan sólo el gen NIS o gen K5 (Bac-hTERT-0-Egr1- K5 y Bac-hTERT-NIS-Egr1-0) se construyeron como controles negativos en este estudio.

INFECCIÓN DE BACULOVIRUS Y LA IRRADIACIÓN DE CÉLULAS

Las células cultivadas (Hela, MRC5 o HUVEC) fueron sembradas en placas de 6 pocillos con DMEM (10% FBS) al menos 24 h antes de la infección. Después de la infección con el baculovirus recombinante a la multiplicidad de infección (MOI) de 2, se incubaron las células durante 6 h con PBS, que luego se intercambió con DMEM (10% FBS) de un 18 h adicionales de incubación

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