Tec. Esp. de Microscopia electrónica

Técnicas Especiales en Microscopia Electrónica

El microscopio óptico nos proporciona una escasa información sobre la organización interna de las células ya que sólo vemos el citoplasma con estructura homogénea, un núcleo y algunas partículas, gránulos y vacuolas poco definidos. El uso de sistemas ópticos más complejos como el contraste de fases y el contraste diferencial de interferencia, así como el empleo de diversas técnicas histológicas e histoquímicas , han permitido observar detalladamente algunos componentes celulares. No obstante, los conocimientos que poseemos sobre la estructura y función de celular se ha obtenido mediante el empleo de método morfológicos, bioquímicos y de la biología celular más sofisticados. La microscopia electrónica es un método morfológico que ha jugado un papel muy importante en el conocimiento de la ultra estructura celular.

Los estudios morfológicos en el microscopio de luz, por lo general se llevan cabo mediante la observación directa en el aparato, en cambio, en la microscopia electrónica, el estudio se realiza frecuentemente en las fotografías tomadas con el microscopio, lsa cuales presentan mejor contraste y proporcionan mayor información sobre los detalles ultra estructurales de las células. Esto se debe a que la emulsión fotográfica que se usa en la microscopia electrónica, es mas sensible y tiene un mayor capacidad de resolución que el ojo humano.

Al hacer la interpretación de una fotomicrografía electrónica de material biológico, se debe tomar en cuenta que proviene de un corte ultrafino, más delgado que los que se obtienen para microscopía óptica. Además debido a que los datos morfológicos están orientados a estudios a nivel subcelular y molecular, es necesario tener, por lo menos, una idea general d los distintos  organelos y estructuras que constituyen las células y correlacionarlos, dentro de lo posible, con datos morfológicos y biquímicos.

En años recientes, se han desarrollado numerosas técnicas que amplían el potencial del microscopio electrónico, las cuales se refieren fundamentalmente a la introducción de determinados procedimientos durante la preparación del espécimen.

Formación de réplicas.

Para observar la superficie de un espécimen opaco a los electrones o que se destruyen con facilidad, se utiliza el método denominado de formación de réplicas. El espécimen se recubre de una delgada capa de platino y a continuación de una capa soporte de carbón, depositándose ambas por evaporación al vacío o por sombreado. Esta doble capa se deposita a continuación en sobre una superficie acuosa y se recoge sobre una rejilla. De este modo la réplica es un facsímil del objeto, es decir, sus contornos son iguales a los contornos de la muestra. Este método se utiliza para el estudio de superficies de virus, membranas y ciertos cristales de proteínas que se destruyen inmediatamente por el haz de electrones.

Criofractura y técnica del punto crítico.

En la formación de réplicas se debe eliminar el agua que contenga la muestra, antes de preparar la réplica, porque la producción de una película por sombreado debe hacerse en el vacío. Ello representa un problema, ya que es usual que las estructuras se colapsen durante el secado al aire. Esto se debe a los efectos de tensión superficial que acompañan a los cambios de fase producidos por el proceso de evaporación del disolvente, La criofractura y el punto crítico evitan los artefactos producidos por el secado. En el método de la criofractura, la muestra se congela con rapidez. A continuación se produce un seccionamiento o fractura y se coloca en el vacío con unas condiciones de presión y temperatura tales que el agua sublima desde la superficie de la muestra. Entonces se prepara una réplica de esta superficie por evaporación de platino o carbón, todavía en condiciones de vacío.

El método del punto crítico se basa en el hecho de que por encima de una “temperatura críta” caraterística para cada sustancia, no puede existir una fase líquida. En el método es como sigue: en primer lugar s empapa en etanol una muestra  húmeda. A continuación el etanol se intercambia con CO2 líquido a presión y a una temperatura de 15°C. Entonces, la temperatura de la muestra se eleva por encima de 31°C (la temperatura crítica), con lo que el CO2 líquido pasa gas. En estas condiciones es muy probable que se conserve una réplica o bien se puede observar a muestra con el microscopio, si ha sido teñida de antemano. Este método es muy útil sobre todo para la conservación de estructuras macromoleculares, si se depositan las moléculas sobre la película a partit de una disolución.

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