Tecnica De PCR

Técnica de PCR.

Introducción

PCR son las siglas en ingles de Polymerase Chain Reaction o Reaccion en Cadena de la Polimerasa. La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79oC a 85oC), de ahí su nombre comercial más conocido: taq polimerasa.

Tecnica base para la realización de una PCR:

• Desnaturalización inicial: 95oC por 5 a 10 m.

• 30 ciclos con desnaturalización a 95oC por 30 s, alineamiento a 50oC por 30 s y extensión a 72oC por tiempo variable

• Extensión final a 72oC por 10 m. (aunque no es estrictamente necesario este último paso, es solo para asegurar que los fragmentos incompletos se terminen de sintetizar).

• Al final se programa la máquina para que conserve los tubos a 4oC.

Materiales y métodos

Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Del ADN extraido se tomaron 2µl y se colocaron en un microtubo y además se añadió 1µl de primer 1, 1µl de primer 2, 2.5µl de Buffer 10x, 1.5µl de MgCl2, 0.5µl de dNTPs, 0.2µl de Taq DNA polimerasa y se completó a un volumen de 25µl con agua desionizada estéril (Todo se realizó por duplicado).

Preparación de controles (Negativo y positivo)

Para el control negativo se añadieron todos los componentes de la reacción mencionados anteriormente excepto el DNA y para el positivo se le adiciono un antígeno viral confirmado.

Desnaturalización, hibridación y elongación

Una vez preparados los tubos de reacción se introdujeron en un termociclador que lleva a cabo las tres etapas de la técnica de PCR modificando temperaturas, desnaturalización 94ºC, hibridación 55ºC y elongación 72ºC cada etapa se realizó por un minuto hasta completar 30 ciclos el equipo automatizado fue programado para realizar los ciclos térmicos y temperaturas de forma exacta.

Bacteria

Preparación de soluciones

Para poder hacer la Extracción de ADN Bacteriano fue necesario preparar soluciones las cuales consistieron en:

• Solución I: Mezclar 50 mM de Glucosa, 25 mM de Tris (pH 8) y 10mM de EDTA (pH 8), esto se esterilizo y almaceno a – 4°C.

• Solución II: Mezclar NaOH al 0.2N con SDS al 1%

• Solución III: Preparar acetato de Potasio al 3M, esto se esterilizo y almaceno a – 4°C

• Buffer TE 1x: mezclar 10 mM de Tris (pH 8) y 1mM de EDTA (pH 8), lo cual fue necesario esterilizarse

Extracción de ADN Bacteriano - Método de lisis alcalina (Sambrock)

Para llevar a cabo una extracción de ADN Bacteriano por medio de una lisis alcalina fue necesario, primeramente tener una colonia de Bacteria, de la cual se tomó una pequeña muestra con una picadura, esto se puso en 2ml de LB y se incubo toda una noche a 37°C. Pasado el tiempo de la incubación se pasó a tubos Eppendorf y se centrifugo durante 5 min a 8000rpm, una vez finalizada esta acción de elimino el LB. Se resuspendió el pellet celular en 100 µL de Sol. I y se homogeneizo con el vortex. Previo a esto se adicionaron 200 µL de Sol. II, lo cual se resuspendió y se mantuvo durante 10 min a 4°C. A continuación se adicionaron 150 µL de Sol. III, esto se homogeneizo con el vortex y se mantuvo bajo las mismas condiciones de tiempo y temperatura del paso anterior. Se llevó a cabo una centrifugación a 10,000 rpm durante 10 min a 4°C. Una vez terminada esta operación lo siguiente fue rescatar el sobrenadante, adicionar 1 µL de ARNasa e incubar por un tiempo de 30 min a 37°C. Una vez realizadas todas estas operaciones lo siguiente fue realizar una serie de tres lavados, los cuales consistieron en mezclar en una relación v/v fenol, centrifugar y recuperar

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