Tecnica PCR

Técnica PCR

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica desarrollada en 1983 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado.

Fundamento e importancia

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.

El proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico.

Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.

Reactivos:

Para realizar la técnica se necesitan:

• Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.

• Dos cebadores o iniciadores, oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de dieciocho a veintidós, que permiten que la polimerasa inicie la reacción. Deben estar enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.

• Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.

• Iones monovalentes, como el potasio.

• Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.

• ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).

• ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

• Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Ciclo de amplificación

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura

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