Técnica PCR

Esta técnica permite amplificar selectivamente una región pequeña del DNA, de modo que partiendo de cantidades iniciales pequeñísimas (teóricamente, una sola copia del fragmento) podrían obtenerse varios miles de millones de copias.

Dicho método se basa en la acción cíclica de una polimerasa de DNA que amplifica selectivamente la región de interés y ninguna otra. Es por ello por lo que este método recibe el nombre de reacción en cadena de la polimerasa (abreviado PCR, en inglés Polymerase Chain Reaction).

El punto central de esta técnica es la síntesis de ADN desde un punto concreto, repetida durante un gran número de veces (ciclos). Por lo tanto, existen dos elementos indispensables para que dicha técnica se pueda llevar a cabo:

1. Debemos conseguir que la amplificación se limite exclusivamente a la región genómica de interés.
2. Utilizar una polimerasa que permita repetir el proceso de síntesis de DNA muchas veces.

Sabemos que la polimerasa de DNA tiene la capacidad de catalizar la síntesis de DNA a partir del extremo 3’ libre de un oligonucleótido. Este oligonucleótido está unido a una cadena complementaria, la cual actúa como molde de la síntesis. Este proceso se da de forma natural durante la replicación del DNA, pero también lo podemos reproducir en un laboratorio. Para ello vamos a emplear pequeñas moléculas de DNA complementarias a una región concreta de la doble hélice. Lo primero que debemos hacer es desnaturalizar la cadena, es decir, debemos inducir la separación de las dos cadenas que forman la doble hélice. Para ello vamos a aplicar calor (a partir de los 92-94 ºC prácticamente todas las moléculas estarán desnaturalizadas). Cuando dejamos de aplicar calor se produce un proceso denominado re-naturalización, éste consiste en que las dos cadenas se vuelven a unir. Cabe destacar que dicho proceso se desarrolla lentamente. Si el proceso se lleva a cabo ante la presencia de pequeños oligonucleótidos cuya secuencia es complementaria a alguna porción de la molécula larga original, estas moléculas se unirán rápidamente a la región complementaria de la molécula larga antes de que llegue a re-naturalizarse. Por lo tanto, cada una de las cadenas originas se mantiene monocatenaria excepto en la región en la que se ha unido el oligonucleótido. En esta región, una polimerasa de DNA puede sintetizar a partir del extremo 3’ libre de la molécula pequeña, usando como molde la secuencia de la molécula grande. Las moléculas cortas que inician la síntesis de DNA se denominan cebadores (primers en inglés). Utilizamos dos cebadores, cada uno de ellos es complementario a una de las 2 cadenas que conforman la doble hélice original, por lo tanto, se van a desarrollar 2 procesos de síntesis en direcciones contrarias. Como resultado, al final obtendremos dos cadenas bicatenarias de DNA con la misma secuencia que la molécula original. La posición de los cebadores determina la región de la molécula larga que se va a amplificar, ya que solo se va a amplificar la secuencia que está comprendida entre los 2 cebadores.

Los elementos que se necesitan para llevar a cabo una reacción PCR son los siguientes: DNA molde que se quiere amplificar, los cebadores, la polimerasa de DNA y, por último, los nucleótidos libres que se van a unir a la cadena que se está sintetizando.

En lo que respecta al DNA molde, cabe mencionar que debe ser puro para asegurar un buen funcionamiento de la reacción. Además, las cantidades necesarias para llevar a cabo la técnica son pequeñas, no deben superar los 100-200 ng por reacción.

Posteriormente vamos a hablar de los cebadores. Los cebadores son oligonucleótidos sintéticos (artificiales) que tienen un grupo hidroxilo libre en el extremo 3’. A partir de dicho extremo se sintetiza la nueva cadena de polinucleótidos. La característica más importante de un cebador es la especificidad, es decir, que sólo se pueda unir a una región concreta del DNA. Esto va a garantizar que solo se amplifique la región de interés. Esto es importante cuando el DNA molde representa un genoma completo o fragmentos cromosómicos grandes. Para ello se utiliza un tamaño mínimo de 17 nucleótidos. Normalmente, los cebadores empleados en las reacciones de PCR típicas están en un rango de tamaños entre los 17 y 25 nucleótidos.

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